میکروسکوپ الکتروشیمیایی روبشی – (بخش سوم)

میکروسکوپ روبشی الکتروشیمیایی ابزاری به سرعت در حال توسعه برای مطالعات سلول‌های زنده است. این میکروسکوپ یک ابزار غیر تماسی است که اگر چه با توان تفكيك میکروسکوپ‌های الکترونی روبشی و نیروی اتمی (AFM) قابل مقایسه نیست اما ابزاری قدرتمند در تصویربرداری سطح سلولی و فعالیت‌های الکتروشیمیایی سلول‌های زنده، در محدوده زیرمیکرون یا حتی در محدوده نانومتر (به‌صورت تلفيق با میکروسکوپ روبشی هدایت یونی SICM) است.
روش‌های مختلف تصویربرداری SECM می‌تواند برای به‌دست آوردن اطلاعات دقیق در مورد مورفولوژی و عملکرد سلول‌های مجتمع و یا تنها، مورد استفاده قرار گیرد.
چندین روش بر اساس SECM برای مطالعه واکنش انتقال بار در سیستم‌های بیولوژیکی، شامل تثبیت آنزیم‌ها و سلول‌ها وجود دارد. همچنین SECM می‌تواند برای تهيه تصوير توپوگرافی و تعیین واکنش‌پذیری گونه‌های بیولوژیکی مورد استفاده قرار گیرد.5-4-1- آزمایش روی سلول‌های زنده
دو نوع اصلی آزمایش SECM روی سلول‌های زنده شامل آزمایش مولد / جمع‌کننده (شکل‌های (7-الف) و (7-ب)) و آزمایش آمپرومتری روش بازخوردی (شکل‌های (7-ج) و (7-د)) است.روش مولد / جمع‌کننده شامل قرار دادن سوزن در نزدیکی میدان سلول‌های تثبیت شده (یا سلول‌های نسبتاً بزرگ مجزا)، با یک فاصله نسبتاً بزرگ به‌منظور چشم‌پوشی بازخورد است. در این حالت سوزن به‌عنوان یک روبشگر مثبت برای ثبت کردن غلظت و یا شارش گونه‌های ردوکس (اکسید و احیا) تولید شده یا مصرف شده از سلول‌ها، به‌منظور اندازه‌گيري فعاليت سوزن، در نظر گرفته می‌شود.

در مقابل، در روش بازخورد فاصله جدایی سلول / سوزن برای مشاهده بازخورد مثبت یا منفی از یک سلول مجزای تثبیت شده، کوچک است و سوزن برای اکسید یا احیا یک واسطه ردوکس استفاده می‌شود و یک سلول به‌عنوان زیرپایه‌اي که توپوگرافی و واکنش‌پذیری ردوکس آن را می‌توان بررسی کرد، استفاده می‌شود.

5-4-2- مطالعه تنفس و دیگر سازوکارهای سلولی
حالت جمع‌کننده سوزن دستگاه SECM به‌طور گسترده‌ای برای مطالعه تنفس و فعالیت‌های فتوسنتزی سلول‌های بیولوژیکی مورد استفاده قرار گرفته است. سیونسکی و همکارانش از روش SECM برای مطالعه برگ‌های یک گیاه به نام ت.فلومینسیس استفاده کردند.ماتسو و همکارانش از روش SECM برای نشان دادن فعالیت‌های تنفس در گستره وسیعی از سلول‌های زنده استفاده کرده‌اند. آنها سرعت شارش اکسیژن، در سطح سلول را در ارتباط با تنفس و فتوسنتز نقشه‌برداری کردند و با اندازه‌گیری سرعت مصرف اکسیژن، برخی از مشکلات زیست پزشکی حساسیت دارویی سلول‌های سرطانی در زیست‌پذیری جنین‌های گاوی را به تنفس میتوکندری در سلول‌های عصبی نسبت داده‌اند.5-4-3- فرایندهای ردوکس سلولی
لیو و همکارانش روش بازخوردی SECM را برای بررسی فعالیت ردوکس سلول‌های واحد پستانداران به کار بردند. به‌منظور بررسی فعالیت ردوکس سلول پستانداران، هر دو شکل اکسید شده و احیا یافته واسطه ردوکس باید بتواند از غشاء سلول عبور کند و انتقال بار، میان الکترود سوزن و مراکز ردوکس درون سلولی انجام شود (شکل (7-ج)).

واکنش‌های ردوکس درون سلولی و سوزن، را می‌توان به‌صورت زیر نشان داد:

(7-الف)                 (در الکترود سوزن)                 O+ne=R
(7-ب)                    (درون سلول)                             R+Ocell→O+Rcell

واکنش (7-الف) یک فرآیند پیچیده است که به ویژگی‌های عامل واسطه (مثل پتانسیل فرمال، باریونی، آبگریزی) وابسته است. از طریق حرکت دادن سوزن (بایاس منفی) به سمت غشاء سلول می‌توان منحنی‌های i_T در مقابل d را برای محاسبه مقادیر ثابت سرعت ناهمگن موثر، بدست آورد.

در بررسی که صورت گرفت، به کمک فرایندهای ردوکس سلولی در سلول‌های سالم و سرطانی پستان، منحنی‌های بدست آمده نشان داد که سلول‌های متاستاز پستان انسان را می‌توان از طریق الکتروشیمی از سلول‌های سالم پستان تشخیص داد.

از مشکلات این روش، لزوم نفوذ سوزن به داخل سلول برای متمرکز نمودن فعالیت‌های ردوکس در قسمت‌های مختلف سلول‌های مختلف است. تلاش‌های اخیر در زمینه کاربرد سوزن‌ها نشان داده است که نانوپروب‌های آمپرومتری امکان اندازه‌گیری‌های کمی سه‌بعدی SECM در درون سلول‌های زنده را فراهم می‌کند. استفاده از سوزن حدود 1000 برابر کوچکتر از سلول، به‌طور قابل ‌توجهی آسیب به غشاء سلول را کاهش داده و ممکن است مطالعات بیولوژیکی سطوح زیرسلولی را در فرایندهای مرتبط با انتقال بار، تسهیل کند.

5-4-4- تصویربرداری از سلول‌های زنده
بیشتر تصاویر SECM سلول‌های زنده با روش ارتفاع ثابت بدست آمده‌اند که در آن، سوزن در حالت افقی در بالای سطح زیرپایه قرار می‌گیرد. با استفاده از این رویکرد می‌توان شارش یا جریان اکسیژن و دیگر گونه‌های ردوکس را ترسیم نمود.

بائز و همکارانش تصوير توپوگرافی یک سلول نورون PC12 را با استفاده از روش ارتفاع ثابت براساس بازخورد منفی SECM تهيه کردند.
از آنجا که غشاء سلول در برابر گونه‌های ردوکس نفوذناپذیر است، در تهيه تصویر توپوگرافی، به‌صورت زیرپایه محافظ، عمل می‌کند.

همچنین روش ارتفاع ثابت نیز در ترکیب با میکروسکوپ فلوئوروسان برای تهيه تصویر انواع مختلف سلول‌های پستان انسان مورد استفاده قرار می‌گیرد  اما مشکل جدی در تهيه تصویر سلول‌های زنده با روش ارتفاع ثابت، تفاوت ارتفاع بین بخش‌های مختلف هر سلول است به‌طوری که تهيه تصویر سلول‌های ناهمگن بدون ایجاد خراش روی آنها ممکن نیست. اگر شعاع سوزن کمتر از اختلاف بین ارتفاع دو سلول باشد، امكان دارد سلول‌های بلندتر در فرآیند تصویربرداری به روش ارتفاع ثابت، خراشیده ‌شوند و یا تهيه تصوير سلول‌های کوتاهتر ميسر نباشد.

مشکل فوق را می‌توان با روش فاصله ثابت، از تصویربرداری SECM حذف نمود. این رویکرد نیازمند یک سیگنال وابسته به مسافت و مدار بازخورد است. بنابراین سوزن می‌تواند به طرف پایین و بالا حرکت کرده و در فاصله ثابت از شیء مورد نظر، نگه داشته شود. در این راستا روش‌های مختلفی از جمله: حالت جریان ثابت، تلفيق AFM-SECM و غیره ایجاد شده‌اند.

روشی دیگر به‌وسیله هوروکس و همکارانش معرفی و توسط دیگران توسعه یافت. در این روش با به کارگرفتن یک کنترلر بازخوردی پیزویی، می‌توان مقدار مقاومت ظاهري سوزن را ثابت نگه داشت؛ بنابراین فاصله جدایی سوزن / زیرپایه ثابت نگه داشته می‌شود.
همچنین تهيه تصویر می‌تواند به‌طور مستقیم در محیط رشد سلول رخ دهد و هیچ واسط ردوکسی مورد نیاز نیست. با استفاده از این روش،کورولاگاما و همکاران به کمک یک سوزن حلقه‌ای کربنی با قطر حدود 1 میکرومتر به تصاویری با کیفیت بالا از مدل نورون‌ها به روش فاصله ثابت دست یافتند (شکل 8).

5-5- مطالعات آنزیم‌های ردوکس
مطالعات اخیر SECM بر آنزیم‌های تثبیت شده، بر دو حوزه متمرکز هستند: اندازه‌گیری فعالیت کاتالیستی آنزیم و ترسیم طرح سطح در ابعاد میکرو، با استفاده از آنزیم. کاربرد کاتالیستی دو روش مولد / جمع کننده (GC) و اندازه‌گیری‌های روش بازخوردی برای بررسی کردن آنزیم‌های ردوکس در شکل (9) نشان داده شده‌است.روش بازخورد (شکل (9-الف)) برای آنزیم‌های فعال با پوشش سطحي زیاد، مناسب است. در مثالی از این روش اکسیدشدن کاتالیستی β-D- گلوکز به D-گلوکز-δ-لاکتون درون لایه‌ای نازک میکرومتری از اکسید گلوکز، توسط پییرس و همکارانش مطالعه شد.
در این روش فرم اكسید شده واسط كه از طریق واکنش کنترل شده سوزن توليد شده، روی سطح زیرپایه به‌وسیله GO، احيا مي‌شود. بدین‌ترتیب واسطه با گلوكز در سطح زیرپایه كاهيده مي‌شود و واكنش با اكسايش گلوكز كاتاليز مي‌شود.روش GC (شکل (9-ب)) حساس‌تر بوده و می‌توان آن را در زمانی که ميزان تحرك آنزیم برای اندازه‌گیری بازخورد كم است، مورد استفاده قرار داد. در این روش، شكل كاهش يافته واسطه به‌طور مداوم به‌وسيله واكنش آنزيم – كاتاليز شده در زیرپایه بوجود مي‌آيد و در سوزن جمع مي‌شود. سوزن توپوگرافی گونه‌هاي واسطه كاهش يافته را بررسي مي‌کند.

روش SECM همچنین برای ساختن و تحلیل ساختارهای آنزیمی میکرومتری در یک سطح، کاربرد دارد که در طراحی بیوحسگرهای مینیاتوری مفید است. همچنین کاربرد روش SECM برای بهینه نمودن کارایی الکترودهای آنزیم مفتولی گزارش شده‌است .
در چنین دستگاهی، آنزیم درون یک زمينه پلیمرهادی روی سطح الکترود تثبیت شده‌است. کارایی الکترود به غلظت یک آنزیم در لایه پلیمري و توانایی زمينه به‌منظور بازیابی آنزیم از طریق کاهش / اکسید نمودن الکترون‌ها روی سطح الکترود، بستگي دارد.5-6-SECM/AFM  و روش‌های تلفيقي دیگر
تاکنون تعدادی از روش‌های تحلیلی از جمله میکروسکوپ نوری میدان نزديك، رزونانس پلاسماي سطحي، ترازوی بلور کوارتز الکتروشیمیایی، طیف‌سنجی فلورسانس، نورتابی شیمیایی الکتروتولید شده، و میکروسکوپ نیروی اتمي (AFM)، با SECM تلفيق شده‌است که روش‌هاي تلفيقي متناظر NSOM-SECM ، EQCM-SECM ، SPR-SECM ، FS-SECM ، ECL-SECM  و AFM-SECM را حاصل کرده است. روش‌های مجتمع شده با SECM سبب کاهش زمان و کاهش مقدار نمونه در اندازه‌گیری و به تبع آن سبب بهبود فرایند می‌شود.در بين روش‌هاي تلفيقي، AFM-SECM به‌طور گسترده‌تري استفاده می‌شود. یکی از نقاط قوت روش AFM-SECM قابلیت موقعیت‌یابی است. با استفاده از حالت AFM، می‌توان سوزن زير ميكرومتري را در نزدیکی سطح زیرپایه قرار داد و فاصله سوزن – زیرپایه را در طول پيمايش سطح، ثابت نگه داشت. بدین ترتیب حالت AFM-SECM به‌طور هم‌زمان نقشه توپوگرافی سطح و نقشه واکنش سطح را تولید می‌کند. این کاربرد سبب شده تا این میکروسکوپ تلفيقي، ابزار مفیدی در تهيه تصویر از زیرپایه با واکنش‌های سطحی غیر یکنواخت و یا توپوگرافی پیچیده، باشد. از آنجا که SECM می‌تواند به‌منظور بررسی فعالیت آنزیم در حالت مولد / جمع کننده مورد استفاده قرار گیرد، AFM-SECM به‌طور هم‌زمان می‌تواند بررسی توپوگرافی از الگوی آنزیم و فعالیت‌های موضعي خود را انجام دهد.

5-7- روش SECM برای بررسی اثر انگشت
کاربرد روش‌های الکتروشیمیایی، به‌عنوان گزینه‌ای جدید در بررسی اثر انگشت که دارای قابلیت‌های منحصر بفرد در کشف جرایم و جنایات است، ارزش ویژه‌ای دارد.
به‌طور کلی 3 نوع شاهد اثر انگشت شامل اثر انگشت محسوس (اثر انگشت جوهری روی سطح)، اثر انگشت فشاری (اثر انگشت روی سطوح نرم) و اثر انگشت پنهان (ناشی از انتقال تراوش‌های انگشت روی سطح)، وجود دارد.

به‌طور متداول در گذشته، تلفيق روش‌هایی نظیر روش‌های دستگاهی (طیف‌سنجی ماوراء بنفش، طیف‌سنجی جرمی، روبش با لیزر) و روش‌های فیزیکوشیمیایی (اسپری کردن ناین هیدرین، پودرپاشی با نیترات نقره و بخار ید)، برای آشکارسازی اثر انگشت پنهان استفاده می‌شد. اگر اطلاعات بدست آمده از اثر انگشت را به سه دسته تقسیم کنیم، الگوی برآمدگی‌ها، الگوی انحرافات از مسیر و الگوی حفره‌ها در داخل اثر انگشت، با این تفسیر می‌توان گفت روش‌های پیشین تنها الگوی برآمدگی‌ها و انحرافات را با وضوح خوب ارائه می‌دادند اما پس از معرفی رنگ‌آمیزی با نقره که اولین بار در سال 1979 توسط سویتزر و همکارانش ارائه شد، می‌توان روش SECM را روشی مناسب با وضوح و کیفیت بالادر شناسایی اثر انگشت پنهان بویژه در ارائه الگوی حفره‌ها، دانست. بدین صورت که مواد زیستی باقی‌مانده از اثر انگشت روی سطح، الکتروفعال نیستند بنابراین، تصویر پنهان یا به‌طور مستقیم با نقره و یا به کمک نانو ذرات طلا که روی تصویر جذب شده‌اند، به كمك نقره رنگ‌آمیزی می‌شوند. در این روش نانو ذرات طلا به‌وسيله یون‌های سیترات پایدار شده و به باقیمانده‌های اثر انگشت می‌چسبند و یون⁺Ag را به Ag⁰ کاهش می‌دهند.
در نتیجه ترسیب نقره به این روش، سبب بزرگ کردن اندازه و سیاه نمودن ذرات و در نتیجه بهبود اثر انگشت می‌شوند.

6- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی
این مقاله از مجموعه مقالات فصل نامه شبکه آزمایشگاهی فناوری‌های راهبردی سال 2017، شماره 16 برگرفته شده است.

نام دستگاه

میکروسکوپ نیروی اتمی

میکروسکوپ پروب روبشی

میکروسکوپ الکتروشیمیایی روبشی

میکروسکوپ الکترونی روبشی

7- نتيجه‌گيري:
در میکروسکوپ الکتروشیمیایی روبشی امکان نقشه‌برداری و ثبت توپوگرافی با روبش سطح امکان‌پذیر است.
در مقایسه با سایر روش‌های میکروسکوپی پروبی روبشی، SECM ویژگی‌های خاص خود را دارد. با تصویربرداری از فعالیت‌های شیمیایی روی سطح، اطلاعات شیمیایی حاصل مي‌شود که مکمل اطلاعات به‌دست آمده از دیگر روش‌ها مثل AFM و SEM است که اساساً توپوگرافی و مورفولوژی نمونه را نشان می‌دهند. به‌علاوه SECM می‌تواند نمونه‌های رسانا و عایق با مساحت سطحی نسبتاً زیاد (مثلاً چند سانتیمتر مربع) و در شرایط فیزیولوژیک را بررسی نماید که این روش را از سایر روش‌های روبشی ریز الکترود متمایز می‌سازد.