آماده‌سازی نمونه‌های زیستی به‌منظور تصویربرداری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی- بخش دوم

انجماد سریع نمونه‌های زیستی پتانسیل خوبی در توقف همه حرکت‌های مولکولی دارد و تقریبا بلافاصله ساختار ظریف را در محل منجمد می‌سازند. آسیب به بلورهای یخ مانع اصلی برای یک تثبیت کرایوی خوب است. رشد بلور یخ تحت تاثیر سرعت انجماد قرار می‌گیرد، سرعت انجماد نیز به نوبه خود با نرخ انتقال حرارت خنک کننده و ابعاد نمونه تعیین می‌شود. برای اجتناب از آسیب فرا ساختاری به نمونه که به علت رشد بلورهای یخ بزرگ ایجاد می‌شود، انجماد سریع ضروری است. پروپان مایع با نرخ انتقال حرارت 3900 C/S  موثرترین خنک کننده‌ای است که تاکنون آزمایش شده‌است و ارزان و خیلی راحت قابل استفاده است [5]. برای بدست آوردن بلورهای یخ آزاد منجمد شده، سلول‌ها باید در نرخ بالای 1000 C/S  منجمد شوند. نمونه‌های خیلی ریز مثل سلول‌های منفرد می‌توانند خیلی سریع منجمد شوند، اما نرخ انجماد پایین‌تر برای نمونه‌های ضخیم‌تر مانند بافت‌ها، منطقه آزاد بلور یخ را به یک لایه چند میکرومتری با نزدیک‌ترین فاصله ازسطح یا محیط انجماد محدود می‌کند [14و15].

3-2- نکات کلی درخصوص تثبیت کردن نمونه‌‌ها
هنگام آماده‌سازی نمونه‌ها، یکی از اولین مفاهیم در نظر گرفته شده، تفاوت بین از بین بردن و تثبیت کردن نمونه است. بیشتر اوقات، اصطلاح تثبیت کردن برای هر دو فرآیند استفاده و گاهی باعث می‌شود فراموش کنیم که آن‌ها یکسان نیستند. بیشتر تثبیت کننده‌های اولیه که امروزه مورد استفاده قرار می‌گیرند از گروه تثبیت کننده‌های آلدئیدها هستند و به خوبی اثبات شده‌است که سلول‌ها پیش از مرگ، می‌توانند مدت زمان قابل توجهی را به‌منظور پاسخ به محلول‌های تثبیت کننده داشته باشند. آمیب کپک لجن رشد یافته روی یک سطح آگار می‌تواند به‌صورت گرد دیده شود و بعد از آن که مخلوط گلوتارآلدهید روی آن ریخته می‌شود، در 30 ثانیه اول فضاهای بین مولکولی ایجاد می‌کند. اگر، ظرف پتری حاوی سلول‌ها ابتدا در معرض بیش از یک قطره تتروکسید اسمیوم 1 درصد برای 3 دقیقه قرار بگیرد، گلوتارآلدهید اضافی باعث هیچ گونه تغییر موفولوژی واضحی در سلول‌ها نمی‌شود. بنابراین، بخارات بسیار فرار و سمی تتروکسید اسمیوم سلول‌ها را از بین می‌برد و سپس گلوترآلدئید آن را تثبیت می‌کند. مهم است فراموش نکنیم که این فرآیندها منحصر به فرد نیستند و می‌توانند متفاوت باشند [13].
به‌طور خلاصه تثبیت آلدهید معمولا کافی است. دو تثبیت کننده اصلی برای این هدف، گلوتارآلدهید و فرمالدهید است. گلوتارآلدهید به سرعت و به‌صورت غیر قابل برگشت از طریق گروه‌های آمین‌هایشان به پروتئین‌ها متصل می‌شوند به طوری که به آرامی در داخل بافت نفوذ کرده و معمولا به‌صورت ترکیبی با فرمالدهید به کار می‌رود. فرمالدهید به‌صورت قابل برگشت به پروتئین‌ها متصل شده اما به علت اینکه مولکولی کوچک است به سرعت در بافت نفوذ می‌کند [16].
تعادل اسمولاریته محلول تثبیت کننده با اسمولاریته داخلی سلول‌ها یا بافت‌های تثبیت شده، به‌منظور حفظ مورفولوژی طبیعی و ساختار خوب حیاتی است [17]. اگر اسمولاریته تثبیت کننده کمتر از سلول‌ها باشد، سلول‌ها آب‌دار و متورم خواهند شد و اگر بیشتر باشد سلول‌ها آب از دست داده و چروک می‌شوند. استرس اسمزی می‌تواند باعث پارگی محفظه‌های داخلی غشاء و توزیع مجدد اجزای داخل سلولی شوند. گلوتارآلدهید، فرمالدهید و تتروکسید اوسمیوم آزادانه از غشاء عبور کرده و فشار اسمزی به سلول‌ها و بافت‌ها کمک نمی‌کند [3، 7، 17].

بسیاری از ساختارهای زیستی به دما حساس هستند. توصیه شده دمای محلول در ابتدای تثبیت شدن همان دمایی باشد که نمونه موقع زنده بودن در آن نگهداری شده‌است. پس از آن که نمونه به خوبی تثبیت شد، دما می‌تواند تا حد دمای اتاق و برای نگهداری طولانی مدت تا 4 درجه سانتی‌گراد پایین بیاید. همچنین برای جلوگیری از آلوده شدن نمونه‌ها به مرور زمان، می‌توان آن‌ها را در یخچال نگهداری نمود. دیگر دلایل تثبیت نمودن در دماهای پایین‌تر عبارتند از:

زمان مورد نیاز کافی به‌منظور تثبیت سلول‌ها و بافت‌ها تا حد زیادی به سرعت پخش تثبیت کننده در نمونه و نرخی که تثبیت کننده با اجزای نمونه واکنش می‌دهد، بستگی دارد. حداقل زمان مورد نیاز برای تثبیت به نوع و اندازه نمونه بستگی دارد. به‌عنوان مثال، به نظر می‌رسد سلول‌های کشت تقریبا بلافاصله تثبیت شوند، اگر چه 15 تا 30 دقیقه در، زمانی امن برای اطمینان از تثبیت کافی است. سلول‌های باکتریایی ممکن است فقط نیاز به 30 دقیقه زمان داشته باشند، در حالی که به‌منظور اطمینان از نفوذ کامل تثبیت کننده، یک قطعه ضخیم‌تر از بافت یک حیوان یا گیاه نیاز به یک شب یا حتی چند روز (تقریبا 8 ساعت) غوطه‌وری در تثبیت کننده خواهد داشت. درصورت لزوم، تقریبا تمام نمونه‌ها را می‌توان در گلوتارآلدهید سرد برای مدت زمان طولانی ذخیره نمود. اما نگهداری نمونه به‌صورت طولانی مدت در تتروکسید اوسمیوم می‌تواند بسیار مخرب باشد و باید اجتناب شود و در نهایت ماهیت برگشت‌پذیر پیوند فرمالدهید ذخیره‌سازی طولانی مدت در تثبیت کننده فرمالدهید را غیرممکن می‌سازد. در نهایت، باید تمام تثبیت کننده‌ها به‌منظور حفظ pH در حدود pH فیزیولوژیک نمونه، بافر شوند که به‌طور معمول برای بافت‌های پستانداران 7/2 تا 7/4 است [3].

برای مطالعه نمونه‌های زیستی توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی لازم است قبل از آنالیز و تصویربرداری، آب و مایعات آلی از نمونه‌ها حذف و یا بی‌حرکت شوند. به عبارت دقیق‌تر، اصطلاح «آبگیری» برای توصیف حذف آب استفاده می‌شود. از آنجا که مواد زیستی به‌طور عمده از آب تشکیل شده‌اند، آبگیری آن‌ها به‌صورت بالقوه با توجه به موارد زیر، فرآیندی بسیار مخرب و ایجاد کننده آرتیفکت است:
1- استخراج مولکول‌ها توسط حلال آب‌گیر؛
2- از بین رفتن مولکول‌ها در اثر از دست دادن آب؛
3- چروکیدگی نمونه به دلیل از دست دادن آب؛
4- شکستن نمونه توسط فصل مشترک هوا و حلال.

چروکیدگی یک آرتیفکت اجتناب‌ناپذیر در آبگیری است، زیرا از دست دادن حلال آب موجود در اطراف مولکول‌ها موجب به هم فشردگی زیاد مولکول‌ها می‌شود [19، 18، 3]. بنابراین، نمونه‌ها باید طوری آبگیری شوند که به آهستگی منقبض شده و در اثر از دست دادن سریع آب از هم نپاشند [3].

بدین منظور بسیاری از روش‌های مختلف از جمله خشک کردن در هوا و آبگیری شیمیایی معرفی می‌شوند. رایج‌ترین حلال‌های آبگیری متانول، اتانول و استون هستند. اتانول و استون به‌طور معمول به‌منظور آبگیری و حفظ ساختار اصلی نمونه‌های زیستی مانند بافت پروتئین استفاده می‌شوند. روند آبگیری با عبور بافت از یک سری غلظت‌های افزایش یافته الکل انجام می‌شود. بلوک‌های بافت به ترتیب در الکل‌های‌ 30 درصد، 50 درصد، 70 درصد، 80 درصد، 90 درصد، 95 درصد و 100 درصد قرار گرفته و آبگیری می‌شوند [20-23]؛ سپس برای اطمینان از اینکه تمام آب حذف شده‌است، بلوک‌ها مجددا در اتانول 100 درصد قرار می‌گیرند. توجه داشته باشید که باید از اتانول خالص استفاده شود و از آنجایی که اتانول جاذب رطوبت است و بخار آب را از هوا جذب می‌کند باید اطمینان حاصل شود که هیچ گونه آبی جذب نشده و اتانول خالص است. به همین دلیل، معمولا شروع آبگیری در 15 درصد تا 30 درصد حلال در آب است و غلظت حلال در گام‌های 15 درصد تا 20 درصد، در نهایت به 100 درصد افزایش می‌یابد [3]. مهم است که بین آبگیری و خشک کردن تمایز قائل شویم، بافت‌ها هرگز نباید در مجاورت هوا خشک شوند. آبگیری شامل خروج آهسته آب از بافت با یک حلال آلی است. آبگیری باید نسبتا سریع صورت گیرد تا از استخراج بیش از حد الکل و ترکیبات محلول در استون جلوگیری شود، اما برای جلوگیری از پلاسمولیز به اندازه کافی آهسته باشد. کنترل استخراج اجزای نمونه دشوار است. کربوهیدرات‌ها به‌خصوص با وزن مولکولی پایین، حساس هستند چون اگر کربوهیدرات‌ها در تمام تثبیت کننده‌ها قرار بگیرند، معمولا اتصال ضعیفی برقرار می‌کنند. پروتئین‌ها در حین تثبیت اولیه و چربی‌ها در حین تثبیت ثانویه به ترتیب تمایل دارند به گلوتارآلدهید و تتروکسید اوسمیوم متصل شوند. کربوهیدرات‌ها اساسا تثبیت نشده هستند. علاوه بر مشکل استخراج، مشکل چروکیدگی نیز وجود دارد، هر یک از این مشکلات در غلظت‌های پایین سری‌های آبگیری بسیار جدی هستند. به‌طور کلی، راه حل این مسایل آبگیری سریع است. با استفاده از الکل 70 درصد بافت تا حد زیادی چروک نمی‌شود اما شروع به سخت شدن می‌کند. در حقیقت، دوره‌های طولانی آبگیری در غلظت‌های بالاتر الکل، می‌تواند بافت را کاملا شکننده کند. اگر در مراحل تثبیت نمونه توقفی نیاز باشد، بیشتر بافت‌شناسان الکل 70 درصد تا 100 درصد را به‌عنوان مکان مناسبی برای توقف نمونه در طی شب می‌دانند. اگر در حین آبگیری پلاسمولیز رخ دهد، ممکن است مراحل اضافه‌تر آبگیری لازم باشد. غشاهای سلولی گاهی بعضی از فعالیت‌های اسمزی را پس از مدت کوتاهی از تثبیت حفظ می‌کنند. زمان‌های طولانی‌تر تثبیت در گلوتارآلدهید می‌تواند حساسیت‌های اسمزی را به خوبی کاهش دهد. غشاها اساسا به تغییرات اسمزی پس از 48 ساعت تثبیت در گلوتارآلدهید غیرحساس می‌شوند. تثبیت ضعیف سبب تشدید مشکلات آبگیری خواهد شد. آبگیری در دمای یخچال کمی سبب کند شدن فرآیند شده و تمایل به سفت کردن بافت دارد و همچنین ممکن است پلاسمولیز را قدری کاهش دهد. بافت‌های زنده خیلی به آبگیری ضعیف حساس هستند، بنابراین آبگیری سرد (در دمای یخچال) برای اینگونه بافت‌ها توصیه می‌شود. همچنین باید در هنگام تعویض محلول دقت نمود تا نمونه خشک نشود، نکته‌ای که خیلی از افراد نسبت به آن بی‌توجه هستند.

به‌طور کلی برای آبگیری بافت‌های زنده مراحل زیر توصیه می‌شود:

4- خشک کردن
بسیاری از نمونه‌های زیستی حاوی مایعات (بیشتر آب) هستند. تبخیر این مایعات می‌تواند تاثیر منفی بر عملکرد دستگاه داشته باشد، بنابراین، بهتر است نمونه قبل از گذاشته شدن در محفظه میکروسکوپ الکترونی روبشی کاملا خشک شود.
هنگامی که آبگیری کامل شد، حلال باید بدون ایجاد آرتیفکت‌های ناشی از خشک کردن یا تنش سطحی در نمونه از بافت خارج شود. این امر از طریق استفاده از یک جریان انتقالی و معمولا به کمک دستگاه‌هایی مانند خشک کن در نقطه بحرانی و‌ خشک کن سرمایشی و گاهی اوقات با استفاده از دی‌اکسید کربن مایع و یا یک سری از حلال‌ها مانند هگزامتیل دی سیلیزان، فرئون 113، تترامتیل سیلان و PELDRI II برای خشک کردن در هوا به‌دست می‌آید. روش‌های ذکر شده نیروهای کشش سطحی بالا را که باعث فروپاشی و چروکیدگی سلول‌ها و ویژگی‌های سطحی آن‌ها می‌شود، کاهش می‌دهد [24، 25، 5].
اگر نمونه‌های زیستی پس از آبگیری در هوا خشک شوند، آرتیفکت‌هایی از قبیل چروکیدگی و فروپاشی ساختارهای سطح به علت اثرات کشش سطحی می‌توانند مشکل‌زا باشند. همان‌طور که سطح مشترک بین آب و هوا، ابتدا از سطح و سپس از بخش توده‌ای نمونه می‌گذرد، نیروهای کشش سطحی مربوط به سطح مشترک می‌توانند تا 13/8 مگاپاسکال افزایش یابند که در نتیجه 45 درصد چروکیدگی در مرحله نهایی خشک کردن در هوا رخ می‌دهد [26]. همچنان که ساختارهای در حال خشک شدن کوچکتر می‌شوند این نیروها به‌طور فزاینده‌ای بزرگتر می‌گردند. افزایش چشم‌گیر نیروهای کشش سطحی به شدت ساختار یکپارچه نمونه‌های نرم را از شکل طبیعی خارج می‌کند و حتی می‌تواند منجر به فروپاشی کامل نمونه‌های توخالی شود. هر تغییر شکلی که رخ می‌دهد می‌تواند به‌صورت اشتباه به‌عنوان ویژگی ذاتی نمونه یا به‌عنوان تاثیر یک رفتار اعمال شده خاص تشخیص داده شود. افزایش نیروهای کشش سطحی همچنین مشکلاتی برای نمونه‌های شامل محلول‌های آلی و غیرآلی حل شده ایجاد می‌کند [5].

1-4- خشک کن نقطه بحرانی
خشک کن نقطه بحرانی (CPD) یک روش متداول آبگیری بافت‌های زیستی قبل از آزمون میکروسکوپ الکترونی روبشی است. این روش اولین بار به‌صورت تجاری برای آماده‌سازی نمونه‌های SEM توسط پلارن در سال 1970 معرفی شد. به‌طور سنتی نمونه‌های زیستی به‌منظور جلوگیری از چروکیدگی توسط CPD مورد پردازش قرار گرفته‌اند [27 و 28]. خشک کن نقطه بحرانی بر این اصل استوار است که در شرایط دما و فشار معین (در نقطه بحرانی)، یک مایع و بخار آن غیر قابل تشخیص خواهند شد (شکل (3)). در این نقطه، تبادل یکسانی از مولکول‌ها بین فازهای مایع و گاز وجود دارد و کشش سطحی نمونه برابر صفر خواهد شد.

برای نمونه‌های زیستی که مساله اصلی حذف آب است نقطه بحرانی (برای آب) با مقادیر  نامناسب بوده و باعث آسیب حرارتی به نمونه می‌شود. دما و فشار بحرانی متانول و دیگر مایعات مشابه نیز بسیار بالاست. در مقابل، دماهای بحرانی فرئون 13 (یک سرد کننده فلوئور و کربنی) و دی‌اکسید کربن مایع کم هستند. با وجود فشار بحرانی کم برای فرئون 13 اما فشار کربن دی‌اکسید مایع مقدار بالایی دارد. از این اطلاعات به نظر می‌رسد که فرئون 13 و دیگر فلوئوروکربن‌های مشابه بهترین گزینه برای خشک کن نقطه بحرانی هستند. اما تصاویر گرفته شده از مواد زیستی نشان می‌دهد که یکپارچگی ساختاری بهتر، زمانی حفظ می‌شود که دی‌اکسید کربن مایع به جای فلوئوروکربن‌ها مورد استفاده قرار گیرد. فلوئوروکربن‌ها به‌عنوان ماده سرد کننده ممنوع هستند، چرا که به‌طور مستقیم با تخریب لایه ازون و گرم شدن هوای جهان در ارتباط‌اند و دیگر به‌طور کلی در دسترس نیستند. به همین دلیل، کربن دی‌اکسید مایع برای خشک شدن در نقطه بحرانی به کار می‌رود. جدول (2) دما – فشار برخی از مواد را نشان می‌دهد.

1-1-4- معایب خشک کن نقطه بحرانی 
اگر چه خشک کن نقطه بحرانی مشکلاتی را که در اثر تاثیرات ناشی از کشش سطحی ایجاد می‌شود، برطرف می‌کند، شواهد قانع کننده‌ای وجود دارد آبگیری و سپس توسط خشک کن نقطه بحرانی می‌تواند به دو روش نمونه‌های نرم را تخریب کند:

یک سری از مطالعات دقیق (بوید و همکاران، 1977 – بوید و مکناچی، 1979) نشانگر آن است که خشک کن نقطه بحرانی سبب افزایش (تا 70 درصد) تغییرات ابعادی ناخوشایند و نابرابر در بیشتر نمونه‌ها می‌شود. بوید و مکناچی (1979)، وولوبر و همکاران (1981) و گاملیل (1985) در مورد مزایای افزودن فلزات سنگین مختلف، عناصر با چگالی بالا و افزودنی‌های آلی که می‌تواند در مراحل تثبیت صورت بگیرد و چروکیدگی را تا 5 درصد کاهش دهد، بحث می‌کنند. گرچه فرسایش و اختلال ویژگی‌های سطح هنوز یک مسئله است [3].

دی‌اکسید کربن مایع، که معمولا دی‌اکسید کربن فوق بحرانی نامیده می‌شود، یک حلال قوی است. برای مثال، می‌تواند برای مواد فلزی، حل کردن یون‌های فلزی، چربی‌ها، پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌ها، بدون کافئین کردن چای و قهوه و حتی از بین بردن کل نیکوتین‌ها از برگ‌های پیچیده تنباکو مورد استفاده قرار گیرد. خشک کن نقطه بحرانی روشی نیست که برای مطالعات ساختاری با قدرت تفکیک بالا در نمونه‌های آلی حساس و ظریف یا بررسی‌های تحلیلی روی هر نوع نمونه استفاده شود. در بزرگنمایی پایین، به‌عنوان مثال، بزرگنمایی 3000 تا 5000 برابر، خشک کن نقطه بحرانی احتمالا برای مطالعات ساختاری قابل قبول است. نمونه‌هایی که در خشک کن نقطه بحرانی در مقایسه با نمونه‌هایی که در هوا خشک می‌شوند خیلی کیفیت عکس الکترونی بالاتری دارند [3].
در نهایت باید به این نکته اذعان کرد که خشک کن نقطه بحرانی روش عالی نیست. چروکیدگی همچنان به میزان 1 درصد، 15 درصد در مواد سیستم عصبی مرکزی، 12–13 درصد در جنین و بافت‌های جنینی و 20 درصد چروکیدگی برای ریه، کلیه، کبد و پوست مشاهده شده‌است [13، 26، 29، 30].
همواره باید در نظر داشت، دستگاه خشک کن نقطه بحرانی که گاهی اوقات بمب نامیده می‌شود، در فشار بسیار بالا کار می‌کند و بطور بالقوه بسیار خطرناک است و باید صرفا توسط افراد آموزش دیده و با رعایت دستور‌العمل‌های سازندگان استفاده شود [1].

2-4- خشک کن انجمادی 
در تئوری باید خشک کن انجمادی (FD) چروکیدگی کمتری نسبت به خشک کن نقطه بحرانی (CPD) داشته باشد [30]، همچنین خشک کن انجمادی از خطرات مشاهده شده (به علت فشار بالا) در فرآیند خشک کن نقطه انجمادی جلوگیری می‌کند. مراحل آماده‌سازی (تثبیت و آبگیری) نمونه با دستگاه خشک کن نقطه انجمادی یکسان است.
کاربرد خشک کن سرمایشی فراتر از آن است که تنها نمونه را به وسیله تصعید آبگیری نماید بلکه احتمالا برای کارهای میکروسکوپی و آنالیز همواره به‌صورت یک فرآیند تجربی کاربرد خواهد داشت. اگرچه دستورالعمل‌های کلی برای کار با دستگاه وجود دارد، اما باید دستورالعمل‌های تجربی برای نمونه‌های موردنظر در راستای بالا بردن کیفیت تصاویر میکروسکوپ الکترونی و صحت آنالیزهای شیمیایی در نظر گرفته شود [1]. در کاربرد میکروسکوپی، دستگاه خشک کن انجمادی برای خارج ساختن حلال از ساختمان مواد زیستی و خشک کردن نمونه‌ها بواسطه ایجاد خلاء در دماهای بسیار پائین بدون تغییر در ساختار استفاده می‌شود. روش کلی کار به این صورت است که حلال منجمد شده موجود در نمونه به وسیله فرآیند تصعید به‌صورت بخار از نمونه خارج و سپس توسط پمپ خلاء از داخل محفظه خشک‌کن مکیده می‌شود. گرمای مورد نیاز برای تصعید از طریق هدایت یا تشعشع، تامین می‌شود.
عملیات خشک کردن انجمادی دارای سه مرحله است: انجماد اولیه، خشک کردن اولیه به‌صورت تصعید در شرایط خلاء و خشک کردن ثانویه با استفاه از تبخیر در شرایط خلاء.

انجماد اولیه: هنگامی که نمونه در اتانول 100 درصد است، می‌تواند در نیتروژن مایع یخ بزند یا به راحتی از حالت اصلی خود خارج شود.

خشک کردن اولیه به‌صورت تصعید در شرایط خلاء: نمونه در جا نمونه‌ای از پیش سرد شده در دمای ℃ 40- تا ℃80- و در شرایط خلاء کم  نگهداری می‌شود و برای بیشتر نمونه‌ها 6-8 ساعت، مونومرها تنها 2-1 ساعت، و نمونه‌ای با ضخامت  ممکن است تا 3 روز باقی بماند. هنگامی که دیگر یخ زدگی در جا نمونه‌ای قابل رویت نباشد، نشان می‌دهد که تمام اتانول منجمد شده تصعید شده‌است و به‌صورت بخار درآمده است [5].

خشک کردن ثانویه با استفاده از تبخیر در شرایط خلاء: نمونه به تدریج در یک بازه 6 ساعته یا بیشتر گرم می‌شود و هنگامی که دمای جانمونه‌ای و نمونه کمی بالاتر از شرایط محیطی قرار بگیرد، بخار موجود در محفظه می‌تواند تخلیه شود. جداسازی بخار، پرهزینه‌ترین بخش فرآیند است. عملی کردن روش خشک کن انجمادی متکی بر این مرحله خلاء است. پمپ خلاء علاوه بر این که بخار حلال منجمد را از محیط خارج می‌کند، موجب پایین نگه داشته شدن فشار در اتاقک خلاء در زیر فشار اتمسفری می‌شود. حذف گازهای غیرقابل میعان، مقاومت در مقابل حرکت بخار آب به داخل کندانسور را کاهش می‌دهد. چون این گازها، موجب کاهش راندمان خشک کن انجمادی می‌شود، پمپ خلاء به کار رفته باید قادر به کاهش فشار اتاقک خلاء تا حداقل ، باشد [1]. در شکل (5) تصویر دستگاه خشک کن سرمایشی آورده شده‌است.