میکروسکوپ الکترونی روبشی یکی از بهترین روشهای آنالیزی است که در حوزه‌های مختلف کاربردهای فراوانی دارد. این میکروسکوپ، امکان بررسی سطح و ریزساختار داخلی را در ابعاد میکرونی و نانومتری فراهم آورده است. امروزه یکی از حوزه‌های تخصصی و مورد توجه، نمونههای زیستی و بافت‌های زنده است. مشاهده این نمونه‌ها و بررسی ریز ساختارهای آن‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی نیازمند آماده‌سازی خاصی است. به دلیل حساسیت بالای نمونه‌ها در صورتی که هر مرحله از آماده‌سازي با دقت کافی صورت نگیرد باعث ایجاد چروکیدگی، فروپاشی و یا آسیب به ساختار نمونه میشود و روي كيفيت تصاویر نهائي تاثير مي‌گذارد، بنابراين بسيار مهم است كه شرايط و مراحل آماده‌سازي بافت با دقت و با روش استاندارد انجام پذيرد.
روشهای بسيار متنوعي براي آماده‌سازي انواع بافت‌های زیستی و آناليز آن‌ها وجود دارند که با توجه به نوع بافت و ساختار آن متفاوت هستند.
در این مقاله به بررسی روشهای کلی آماده‌سازی نمونههای زیستی و بافت‌های زنده شامل: (الف) تثبیت‌های مختلف (تثبیت شیمیایی و تثبیت فیزیکی)، (ب) آبگیری با درصدهای مختلف الکل و (ج) روشهای مختلف خشک کردن (خشک کردن در هوا، خشک کن نقطه بحرانی، خشک کن انجمادی و خشک کن‌های شیمیایی) به‌منظور مشاهده ساختارهای زیستی در نزدیکترین حالت به ساختار زنده آن‌ها در SEM با قدرت تفکیک بالا پرداخته شده‌است. این مقاله شامل سرفصل های زیر است:
1- جمع آوری نمونه
2- تثبیتامروزه، میکروسکوپ الکترونی روبشی نه تنها در علوم مواد، شیمی و فیزیک به کار می‌رود، بلکه در زمینه‌های متعددی همچون علوم پزشکی و زیستی کاربرد دارد. قدرت تفکیک بالای SEM آن را به یکی از ابزارهای قدرتمند و جامع برای بررسی و تحلیل محدوده وسیعی از مشخصات ریزساختار نمونه‌ها در مقیاس نانومتر تا میکرومتر تبدیل می‌کند.
مواد زیستی، بافت‌های زنده‌ای هستند که در اصل 99 درصد ساختار شیمیایی آن‌ها را عناصر سبک (20-1=Z ) تشکیل می‌دهند، به طوری که بیشتر از عناصر H, C, N, O و درصد کمتری از عناصر Ca, Na, Mg,Si,P,S, Cl, K ساخته شده‌اند. 1 درصد باقیمانده به‌طور عمده از عناصر 30-24 =Z =تشکیل شده‌اند که شامل عناصر کمیاب Zn،Mn،Fe،Cu،Co،Cr وI است و در متالوآنزیم‌ها و کوآنزیم‌های مختلف نقش مهمی دارند. آب جزء اصلی نمونههای زیستی زنده است و ماکرومولکول‌های آلی پیچیده‌‌ای مانند پروتئین‌ها، لیپیدها و کربوهیدرات‌ها را شامل میشود. عناصر مختلف تشکیل دهنده سلول عبارتند از: 59 درصد هیدروژن (H)، 24 درصد اکسیژن (O)، 11 درصد کربن (C)، 4 درصد نیتروژن (N)، 2 درصد دیگر موارد، مثل فسفر (P)، سولفور (S) و غیره [2].
یکی از مهمترین چالش‌ها در تفسیر تصاویر SEM نمونههای زیستی، توانایی ایجاد تمایز بین ویژگی‌هایی است که منعکس کننده ساختار طبیعی و ویژگی‌هایی که در هنگام پردازش به‌صورت مصنوعی ایجاد می‌شوند، هستند. اگر این تمایز صورت نگیرد، حتی بهترین و با کیفیت‌ترین قدرت تفکیک‌ها می‌توانند تصاویر بی‌مفهومی را نتیجه دهند. این ساختارهای مصنوعی القا شده را آرتیفکت (مصنوعات) می‌نامند. مسئله تمایز ساختارهای واقعی از آرتیفکت‌ها با این واقعیت همراه است که بیشتر تصاویر میکروسکوپی به‌طور مستقیم از ساختارهای زیستی به‌دست نمی‌آیند، بلکه لکه‌ها، رنگ‌ها یا روکش‌ها نیز به نمونه‌ها اضافه می‌شوند تا بخش مورد نظر را قابل مشاهده سازند که خود عامل ایجاد آرتیفکت هستند [3].
علاوه بر فراهم نمودن اطلاعات سودمند، باریکه الکترونی به کار رفته در یک SEM می‌تواند آسیب موقت یا دائمی را در ساختار سطحی و یا ساختار بالک نمونه ایجاد کند. روش دسته‌بندی این آسیب براساس نوع پراکندگی الکترونی (الاستیک یا غیرالاستیک) است (شکل (1)) [4]. مواد زیستی از رساناهای ضعیف یا نارساناهای حرارت و الکتریسیته هستند که نسبت به آسیب تابشی بسیار حساسند [5].
شکل (1): طبقه‌بندی آسیب تابشی با توجه به نوع الکترون و تاثیر ایجاد شده در نمونه [4].
به‌منظور مشاهده ریزساختار بافت‌های زنده با استفاده از SEM، برخی ملاحظات مورد نیاز خواهند بود. SEMهای متداول در خلاء بالایی کار می‌کنند تا از تداخل مولکول‌های گازی با باریکه الکترونی اولیه و همچنین الکترون‌های ثانویه یا الکترون‌های پس پراکنده شده از نمونه جلوگیری کنند. این بدان معناست، هر نمونه‌ای که وارد SEM میشود باید کاملا خشک و بدون هر گونه آلاینده آلی که ممکن است به‌صورت بالقوه در محیطی با خلاء بالا گاز خارج کند، باشد. این قضیه مشکلی را در بررسی نمونههای زیستی که تا حد زیادی از آب تشکیل شده‌اند به وجود می‌آورد و اعمال مراحل آماده‌سازی اضافی به‌منظور حفظ ساختار طبیعی موجود زنده الزامی است. مراحل لازم به نوع نمونه و هدف بررسی بستگی دارند، برخی از انواع بافت‌ها یا نمونههای زیستی نیازمند پردازش کمتری برای حفظ ساختار خود هستند در حالی که آماده‌سازی دیگر نمونههای حساس‌تر، به زمان و دقت بیشتری نیاز دارند تا از ایجاد آرتیفکت‌های ناشی از خشک شدن، مانند چروکیدگی و فروپاشی بافت جلوگیری شود [5].
نتایج مطالعات مورفومتریک روی برش‌های بافت ممکن است به‌طور قابل توجهی تحت تاثیر روشهای آماده‌سازی نمونه مانند تثبیت، آبگیری و جاسازی و در واقع نوع بافت قرار بگیرد. بسیاری از نمونههای زیستی از طریق تثبیت و آبگیری آماده‌سازی شده و پس از خشک شدن با فلزی همچون طلا، پلاتینیوم یا پالادیوم روکش می‌شوند تا سطوح آن‌ها از نظر الکتریکی برای تحلیل SEM رسانا باشد. نمودار (1) و شکل (2)، به ترتیب مراحل اصلی به کار رفته در آماده‌سازی تمامی نمونههای زیستی برای مشاهده توسط SEM را شرح می‌دهند. ماهیت و ترکیب مراحل به کار رفته با توجه به ماهیت نمونه، نوع روش میکروسکوپی و اهداف خاص علمی متغیر است. به‌منظور بررسی بیشتر روشهای مختلف آماده‌سازی نمونههای زیستی برای SEM، لطفا به مراجع [6-8] مراجعه کنید. در اینجا هر مرحله به‌صورت مختصر توصیف میشود [5].
شکل (2): فرآیند آماده‌سازی بافت‌های زنده برای تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی [5].
1. جمع‌آوری نمونه
جمع‌آوری نمونه از بافت‌ها حائز اهمیت و بر نتایج نهایی موثر است. در جمع‌آوری نمونه زیستی، برش بافت‌ها باید به دقت انجام شود. برای مثال، در زمان برش یک قسمت کوچک از بافت‌ها برای اهداف تشخیصی، باید در چگونگی نگه داشتن و برش نمونه دقت کافی به کار گرفته شود [5].
2. تثبیت
اولین و مهمترین مرحله پس از انتخاب نمونه برای مطالعه بافت‌های زنده، روش تثبیت سریع و مناسب آنهاست. هدف اولیه تثبیت، پایدارسازی ساختار نمونه است به طوری که بتواند مراحل پردازش و آزمایش را با SEM تحمل کند. پیش از آنکه تجزیه سلولی بلافاصله پس از مرگ یک اندام زنده اتفاق بیفتد، باید سلول‌ها را تثبیت نمود تا از تغییرات ساختار از طریق تجزیه، جلوگیری به عمل آید. تثبیت متداول شامل شبکه‌سازی شیمیایی پروتئین‌ها (برای جلوگیری از حرکت آنزیم و گوارش) و حذف آب برای تغییر بیشتر پروتئین‌های سلولی است. یک ساختار تثبیت شده سبب توقف فرآیندهای سلولی شده و با هدف حفظ نمونه در نزدیکترین حالت ممکن به حالت طبیعی ایجاد میشود. مشخصات یک تثبیت کننده مناسب عبارتند از:
– نفوذ راحت به سلول‌ها؛
– عملکرد سریع؛
– تغییرناپذیری؛
– عدم ایجاد آرتیفکت‌های تثبیت [5].
روشهای تثبیت به دو نوع اصلی تقسیم می‌شوند: شیمیایی و فیزیکی (جدول (2)). تثبیت شیمیایی بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد، اما استفاده از روشهای فیزیکی، به‌خصوص انجماد، افزایش قابل ملاحظه‌ای یافته است [3].
جدول (2): تثبیت کننده‌های زیستی رایج برای میکروسکوپ‌های نوری و الکترونی [3].
1-2- تثبیت شیمیایی
در مبحث تاثیرات تثبیت کننده‌های شیمیایی روی نمونه‌ها، چند عامل باید در نظر گرفته شود:
– ماهیت ماده تثبیت کننده؛
– ساختار حاملی که ماده تثبیت کننده در آن حل شده‌است؛
– شرایط فیزیکی که تثبیت تحت آن صورت گرفته است.
مواد تثبیت کننده شیمیایی در دو دسته اصلی قرار می‌گیرند: آن‌هایی که با تغییر ماهیت و انعقاد ماکرومولکول‌های زیستی تثبیت می‌کنند و دسته دیگر با شبکه‌سازی کووالانسی ماکرومولکول‌ها باعث تثبیت می‌شوند. مواد تثبیت کننده‌‌ای مانند استون، اتانول، و متانول (که سبب تغییر ماهیت می‌شوند) سبب حفظ بسیار ضعیف ریزساختار شده و تقریبا فقط برای میکروسکوپی نوری سودمند هستند. در مقایسه، مواد تثبیت کننده شبکه‌ساز، از طریق معرفی شبکه‌های بین مولکولی و گاهی درون مولکولی بین ماکرومولکول‌ها، حفاظت ساختاری عالی را فراهم می‌کنند. رایج‌ترین مواد تثبیت کننده شبکه‌سازی شامل فرمالدهید برای میکروسوپ نوری و گلوتارآلدهید و تتروکسید اوسمیوم برای SEM هستند [5].1-1-2- فرمالدهید (FA)
فرمالدهید (FA) با فرمول ( CH2O ) یک مونو آلدهید است که با گروه‌های آمین واکنش داده و شبکه‌هایی را بین ماکرومولکول‌های مجاور، به‌طور عمده پروتئین‌ها، تشکیل می‌دهد. به دلیل آنکه شبکه‌سازی براساس تشکیل یک پل متیلن بین دو مولکول فرمالدهید است، شبکه‌ها کوتاه بوده و می‌توانند با هیدرولیز به حالت اولیه برگردند. فرمالدهید برای میکروسکوپ نوری بسیار سودمند است. کاربرد فرمالدهید برای قدرت تفکیک بالا محدود است. برای SEM، تثبیت فرمالدهید باید همراه با تثبیت بیشتر در گلوتارآلدهید باشد [5].2-1-2- گلوتارآلدهید
گلوتارآلدهید (GA) یک دی آلدهید است که می‌تواند به‌صورت هم‌زمان با دو آمین واکنش دهد تا شبکه‌های درون و بین مولکولی، به‌طور عمده با پروتئین‌ها، را به وجود آورد. گلوتارآلدهید همچنین با خودش واکنش می‌دهد تا مولکول‌های شبکه‌ای چند ظرفیتی شاخه‌دار و بلندی را تشکیل دهد. این مولکول‌های شبکه‌ای می‌توانند فاصله بین پروتئین‌های مجاور را در بر بگیرند و شبکه‌های چندگانه و اساسا بازگشت ناپذیری را به وجود آورند که سیتوپلاسم کل سلول را به یک ژل ماکرومولکولی تبدیل کند. گلوتارآلدهید یک ساختار ظریف را حداقل تا سطح تفکیک‌پذیری ماکرومولکولی حفظ نموده و آن را نسبت به مراحل پردازش مختلف مورد نیاز به‌منظور آماده‌سازی برای SEM بسیار مقاوم می‌سازد به طوری که این تثبیت کننده را به انتخابی ثابت، تقریبا برای تصویربرداری میکروسکوپی تمام نمونههای زیستی تبدیل می‌کند. با وجود آن گلوتارآلدهید لیپیدها را تثبیت نمی‌کند، اما به خوبی سبب تثبیت غشاهای زیستی میشود که در مقابل استخراج با مواد شوینده مقاوم بوده و سلول‌های تثبیت شده با گلوتارآلدهید از لحاظ اسمزی برای مدتی پس از تثبیت فعال باقی می‌مانند [9، 6، 3].
نسبت نفوذ گلوتارآلدهيد به داخل بافت بسيار آهسته است، در بافت‌هاي فشرده نسبت نفوذ، كمتر از 1mm/hاست. گلوتارآلدهيد معمولا به‌صورت تجاري در غلظت 25 درصد وجود دارد كه با استفاده از بافر فسفات( 0/1M ) و يا بافركاكوديلات ( 0/1M )رقیق شده و غلظت بین 1/5 درصد تا 3 درصد (با توجه به نوع بافت) به‌دست آمده و در شرایط دمای 4 درجه سانتی‌گراد و 7/4 – 7/2 = PH مورد استفاده قرار می‌گیرد. گلوتارآلدهيد بايد در يخچال نگهداري شده تا از پليمريزه شدن آن جلوگيري شود، از طرفی این تثبیت کننده بسيار سمي است به طوری که بايد از تنفس و تماس با آن بشدت احتراز نمود و حتي‌الامكان در زير هود قوي با این ماده سمی کار شود [10].3-1-2- تتروکسید اوسمیوم
تتروکسید اوسمیوم (OT) به‌عنوان یک ماده تثبیت کننده ثانویه رایج برای SEM است، چرا که با بیشتر لیپیدها شبکه‌سازی کرده و آن‌ها را نسبت به استخراج توسط حلال‌های آلی به کار رفته در مرحله آبگیری مقاوم می‌سازد .با وجود آن که تتروکسید اوسمیوم از غشاهای زیستی محافظت می‌کند، اما سبب غیرفعال شدن آن‌ها از نظر اسمزی شده و آن‌ها را نسبت به آب نفوذپذیر می‌سازد. اما به دلیل آن که تتروکسید اوسمیوم می‌تواند به پروتئین‌ها و دیگر اجزا آسیب برساند، بهتر است که نمونه‌ها با اوسمیم تثبیت نشوند، مگر آن که علت خاصی برای استفاده از آن وجود داشته باشد [11-12].
نسبت نفوذ تتروكسيد اوسميوم mm/h است. نمونه‌هایی كه از اين اندازه بزرگتر باشند در وسط بافت تثبیت نشده باقی می‌مانند و برای میکروسکوپ الکترونی مناسب نیستند. تتروكسيد اوسميوم معمولا با غلظت 1-2 درصد و در زمان 1 الی 1/5 ساعت استفاده مي‌شود. بخار تتروكسيد اوسمیوم هم براي چشم و هم براي تنفس بسيار سمي است و حتما بايد در زير هود كار شود. تتروكسيد اوسمیوم را مي‌توان هم در آب مقطر و هم در بافر تهيه كرد و در ظرف شيشه‌اي داخل يخچال نگهداري نمود [10].4-1-2- واکنش‌گرهای شبکه‌سازی پروتئینی
واکنش‌گرهای شبکه‌سازی پروتئینی دو عملکردی، شبکه‌های درون و بین مولکولی بین پروتئین‌ها را تشکیل می‌دهند، در نتیجه مشابه با گلوتارآلدهید عمل می‌کنند، به جز آنکه که برای تشکیل واکنش‌گرهای چند ظرفیتی به خود وابسته نیستند (با خود واکنش نمی‌دهند). فاصله‌ای که آن‌ها می‌توانند شبکه‌ها را تشکیل دهند، با طول مولکول بین دو انتهای واکنشی آن تعیین میشود.
انواع زیادی از واکنش‌گرهای شبکه‌سازی پروتئین دو عملکردی به‌صورت تجاری در بازار موجود هستند، که به‌طور عمده توسط پیرس معرفی شدند، اما تعداد کمی از آن‌ها به‌عنوان مواد تثبیت کننده برای میکروسکوپی آزمایش شدند [3].5-1-2- تثبیت بخار
به‌صورت کلی، همان‌طور که گفته شد، تثبیت نمونههای زیستی برای SEM از اصول و مواد یکسانی بهره می‌گیرد. اما برخی از نمونه‌ها به سادگی دچار آسیب می‌شوند، بنابراین غوطه‌وری در مایع برای آن‌ها مناسب نخواهد بود. این به‌خصوص برای هایف‌های قارچی و هاگدان‌های آن‌ها (کونیدی) که با لمس کردن از گیاه والد خود جدا می‌شوند حائز اهمیت است. تثبیت بخار شامل استفاده از یک قطره ماده تثبیت کننده در نزدیکی نمونه در یک محفظه کاملا بسته است. در مورد ماده برگ، تتروکسید اسمیوم 4 درصد (ساخته شده در آب)، در حدود بعد از 1 ساعت نمونه را تثبیت می‌کند. این نمونه درصورت تثبیت شدن به رنگ مشکی در می‌آید که این تغییر رنگ به ارزیابی پیشرفت کمک می‌کند. پس از تثبیت می‌توان نمونه را با قرار دادن در یک بلوک فلزی که با نیتروژن مایع خنک میشود، منجمد نمود و سپس به روش خشک کردن انجمادی (فریز درای) خشک کرد. معمولا تثبیت کننده ثانویه تتروکسید اوسمیوم را می‌توان حذف کرد، ولی نمونه‌هایی که دارای «مشکل شارژ شدن» هستند و منجر به اعوجاج تصویر می‌شوند، بیشتر می‌توانند از تثبیت با محلول اسید اسمیک بهره‌مند شوند [13].2-2- تثبیت فیزیکی
همان‌طور که قبلا در جدول (2) ذکر شد، دو جایگزین برای مواد شیمیایی به‌منظور تثبیت مواد زیستی حرارت‌دهی و انجماد هستند. هر دو روش برای میکروسکوپ نوری به کار می‌روند، اما انجماد (تثبیت کرایو) بهترین جایگزین برای تثبیت شیمیایی به‌منظور حفظ ساختار ظریف زیستی در میکروسکوپی با قدرت تفکیک بالا است [5].نتیجه‌گیری
در میکروسکوپ الکترونی روبشی هر مرحله مورد نیاز برای آماده‌سازی نمونههای زیستی برای تصویربرداری می‌تواند ساختار بومی را تغییر داده و ساختارهای جدیدی نامطلوبی مانند چروکیدگی و آرتیفکت را ایجاد کند. از این رو باید روشهای فنی به‌منظور آماده‌سازی این نوع نمونه‌ها مورد توجه قرار گیرد. انجام مراحل آماده‌سازی با توجه به نوع بافت و ساختار برای هر نمونه در کلیات مانند تثبیت، آبگیری و خشک کردن یکسان اما در جزییات مراحل مانند نوع ماده تثبیت کننده، درصدهای مختلف الکل و نوع الکل (اتانول و متانول) و طریقه خشک کردن ( نوع دستگاه یا ماده) متفاوت است که از روی دستورالعمل‌‌های موجود یا برای نمونههای جدید به‌عنوان یک کار تجربی نو قابل دسترسی است.
منابـــع و مراجــــع
۱ – Echlin P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron MicroscopyX-Ray Microanalysis. UK: Springer; 2009.
۲ – Alberts A, Johnson J, Lewis J, Raff M, Roberts k, Walter P. Molecular Biology of the Cell. 5th ed. 2007.
۳ – Bell PB, Safiejko-Mroczka B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by lightelectron microscopy. Intl J Imag Sys Tech. 1997; 8(3):225-39.
۴ – Egerton RF, Li P, Malac M. Radiation damage in the TEMSEM. Micron. 2004; 35(6):399-409
۵ – Mehdizadeh Kashi A, Tahermanesh K, Chaichian SH. How to Prepare Biological SamplesLive Tissues for Scanning Electron Microscopy (SEM). GMJ.2014; 3(2):63-80
۶ – Brunk U, Bell PB, Collins VP, Forsby N.SEM of cells in culture: Osmotic effects during fxation. SEM/IITRI. 1975; 8:379-86.
است. نمونه‌هایی كه از اين اندازه بزرگتر باشند در وسط بافت تثبیت نشده باقی می‌مانند و برای میکروسکوپ الکترونی مناسب نیستند. تتروكسيد اوسميوم معمولا با غلظت 1-2 درصد و در زمان 1 الی 1/5 ساعت استفاده مي‌شود. بخار تتروكسيد اوسمیوم هم براي چشم و هم براي تنفس بسيار سمي است و حتما بايد در زير هود كار شود. تتروكسيد اوسمیوم را مي‌توان هم در آب مقطر و هم در بافر تهيه كرد و در ظرف شيشه‌اي داخل يخچال نگهداري نمود [10].4-1-2- واکنش‌گرهای شبکه‌سازی پروتئینی 
