کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا-بخش دوم

کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، فرم بهبود یافته کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) است که با انجام خودکار مراحل کروماتوگرافی باعث افزایش تفکیک‌پذیری و اندازه‌گیری کیفی و کمی با دقت و صحت بالاتری می‌شود. این روش، جایگزین دیگر روش‌های کروماتوگرافی نیست. در مقایسه با سایر روش‌های کروماتوگرافی، زمان و هزینه آنالیز با این روش بسیار پایین است و در جای خود توانایی‌های منحصر به فردی را نیز دارا است. در بخش اول این مقاله به موضوعات مقدمه، تعریف کروماتوگرافی، روش‌های کروماتوگرافی، کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، مزایا و قابلیت‌های دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، مقایسه روش‌های کروماتوگرافی، فرآیند کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، فرآیند نمونه‌گذاری و انواع دستگاه‌های نمونه‌گذاری در کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا پرداخته شد.

این مقاله شمال سرفصل‌های زیر است:
1- سیستم‌های توسعه فرآیند کروماتوگرافی
1-1- انواع تانک‌های کروماتوگرافی
1-1-1- تانک شیشه‌ای دوقلو
2-1-1- تانک توسعه کروماتوگرافی افقی
3-1-1- دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار
4-1-1- دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار چند حلاله
2- فرآیندهای بعد از کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا
1-2- سیستم مشتق‌سازی
2-2- روش‌های انتقال معرف روی سطح صفحات TLC
3- دستگاه غوطه‌وری
4- دستگاه‌های ارزیابی و سنجش
5- دستگاه پیشرفته TLC-MS
1-5- سازوکار دستگاه TLC-MS
6- مستند سازی و ارزیابی با دستگاه TLC Visualizer
1-6- ویژگی‌های دستگاه TLC Visualizer
7- دستگاه تشخیص لومینسانس زیستی
8- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی
9- نتیجه‌گیری

1- سیستم‌های توسعه فرآیند کروماتوگرافی

در کروماتوگرافی لایه نازک بر خلاف روش‌های کروماتوگرافی، علاوه بر فاز ساکن و متحرک، فاز گازی هم می‌تواند به میزان قابل توجهی جداسازی را تحت تأثیر قرار دهد، که این فاز گازی همان بخار حلال درون تانک است [1].

1-1- انواع تانک‌های کروماتوگرافی

1-1-1- تانک شیشه‌ای دوقلو

تانک شیشه‌ای دوقلو (تصویر 1) با توجه به دلایل زیر اثری ویژه بر بهبود جداسازی در HPTLC دارد [1]:

• مصرف کم حلال: صفحات (20×20)20 میلی‌لیتر، صفحات (10×20) 10 میلی‌لیتر و صفحات (10×10) 5 میلی‌لیتر؛
• تکرارپذیری از طریق پیش تعادل با فاز بخار؛
• توسعه سریع فرآیند کروماتوگرافی هم‌زمان با عبور حلال از روی فاز ساکن.

تصویر 1: تانک شیشه‌ای دوقلو [1].

2-1-1- تانک توسعه کروماتوگرافی افقی

انجام فرآیند کروماتوگرافی در تانک افقی (تصویر 2) مقرون به صرفه، انعطاف‌پذیر و مناسب برای نمونه‌گذاری از هر دو طرف صفحات لایه نازک است.
در تانک‌های افقی با امکان نمونه‌گذاری روی دو سمت صفحات کروماتوگرافی، ظرفیت نمونه‌گذاری نسبت به جداسازی در تانک‌های عمودی دو برابر می‌شود [1].

شکل 2: تانک شیشه‌ای افقی [1].

3-1-1- دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار

دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار، دستگاهی بی‌نظیر در تکرارپذیری فرآیند توسعه کروماتوگرافی لایه نازک است. این دستگاه علاوه‌بر بی‌اثر کردن خطای اپراتور، با تنظیم محیط اشباع و فعال‌سازی صفحات، فرآیند را قبل از شروع کروماتوگرافی درکنترل خود دارد و با کنترل خروجی حلال، از آلودگی محیط آزمایشگاه جلوگیری می‌کند [1].
دستگاه خودکار توسعه فرآیند کروماتوگرافی با ایمنی و تکرارپذیری بالا برای توسعه ایزوکراتیک صفحات TLC/HPTLC در ابعاد 10×10 و 20×10 مناسب است.
ADC2 (تصویر 3) قلب دستگاه HPTLC است و قابلیت انجام مرحله توسعه به‌طور کاملاً خودکار (مستقل از اثرات محیطی)، فعال کردن لایه (خشک کردن)، پیش آماده‌سازی لایه (اشباع) و در نهایت، خشک کردن نهایی، کنترل عوامل محیطی رطوبت و دما (امکان تجدیدپذیری و تنظیم فعالیت لایه)، ثبت اطلاعات و گزارش‌گیری لحظه به لحظه فرآیند را دارا است [1].
از ویژگی‌های کلیدی این دستگاه می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• توسعه فرآیند کاملا خودکار؛
• کنترل و ثبت اطلاعات نرم‌افزاری؛
• کنترل عوامل محیطی رطوبت و دما؛
• قابلیت نظارت و ردیابی لحظه به لحظه عملیات کاربر؛
• دارای سیستم کنترل رطوبت، امکان تجدیدپذیر بودن و تنظیم فعالیت لایه را می‌دهد.

شکل 3: دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار [1].

4-1-1- دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار چند حلاله

دستگاه AMD2 (تصویر 4) مخصوص نمونه‌های حاوی اجزای قطبی و غیرقطبی است.
کروماتوگرافی براساس یک شیب حلال از قطبی به غیرقطبی در چندین مرحله با خشک شدن نسبی بین هر مرحله انجام می‌شود. در این دستگاه از حالت گرادیانی با قابلیت تکرارپذیری و سیلیکاژل به‌عنوان فاز ساکن استفاده می‌شود.
در دستگاه کروماتوگرافی مایع، در حالت گرادیانی، از ستون فاز معکوس استفاده می‌شود؛ زیرا ستون سیلیکاژل برای استفاده بعدی تخریب‌پذیر بوده و قابل برگشت نیست در حالی که در HPTLC چون صفحات یکبار مصرفند، این مشکل بی‌اهمیت است [1].
از ویژگی‌های کلیدی این دستگاه باید به توسعه فرآیند کروماتوگرافی گرادیانی و بهبود توان جداسازی تا 3 برابر اشاره نمود [1].

شکل 4: دستگاه توسعه کروماتوگرافی خودکار چند حلاله [1].

2- فرآیندهای بعد از کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا

1-2- سیستم مشتق‌سازی

با توجه به مواردی که در زیر به آن اشاره می‌شود، مشتق‌سازی را باید به‌عنوان یکی از مراحل TLC در نظر گرفت [1]:

• تغییر مواد غیرجاذب نسبت به (تابش فرابنفش و بازتابش فلورسنت) به مشتقات قابل تشخیص؛
• بهبود شناسایی (کاهش حد تشخیص)؛
• تشخیص تمام اجزاء نمونه؛
• انتخابی کردن شناسایی ترکیب خاص؛
• اتصال ترکیبات فلورسنت به آنالیت.

2-2- روش‌های انتقال معرف روی سطح صفحات TLC

• تماس سطح صفحات با معرف در حالت گازی؛
• اسپری کردن (تصویر 5) معرف روی سطح صفحات؛
• غوطه‌وری صفحات در محلول معرف [1].

شکل 5: اسپری پاشش معرف مشتق‌سازی [1].

3- دستگاه غوطه‌وری

برای انجام مناسب روش غوطه‌وری، دستگاه غوطه‌وری (تصویر 6) با کنترل سرعت غوطه‌وری صفحات کروماتوگرافی لایه نازک باعث می‌شود مشتق‌سازی به‌گونه‌ای یکنواخت در تمام سطح صفحه انجام شود [1].
ویژگی‌های کلیدی:

• زمان غوطه‌وری بین 8-1 ثانیه و نامحدود، مناسب برای صفحات با ارتفاع cm 20 و cm 10؛
• سرعت یکنواخت عمودی بین mm/s 30 و mm/s 50.

شکل 6: دستگاه غوطه‌وری در معرف مشتق‌سازی [1].

4- دستگاه‌های ارزیابی و سنجش

اسکنر صفحات کروماتوگرافی لایه نازک (تصویر 7)، پیشرفته‌ترین ابزار برای سنجش کمی اجزاء جدا شده نمونه روی صفحات TLC و HPTLC از طریق سنجش تراکم جذب و نشر اجزاء جدا شده روی صفحات است. همچنین این ابزار امکان شناسایی ترکیبات را از روی طیف جذبی آن‌ها فراهم می‌کند [1].
این دستگاه دارای نرم‌افزاری است که به کمک آن امکان گزارش‌گیری ارزیابی کمی و ترسیم منحنی کالیبراسیون غلظت و محاسبات آماری و نمایش گرافیکی داده‌های اجزای تشخیص داده شده را فراهم می‌سازد [1].
ویژگی‌ها:

• اندازه‌گیری تابش و بازتابش فرابنفش و فلورسنت؛
• اسکن صفحات تا ابعاد 20×20؛
• گستره طیفی nm900-190؛
• مجهز به لامپ‌های دوتریوم، هالوژن – تنگستن، لامپ بخار جیوه؛
• سرعت اسکن mm/s100-1؛
• تشخیص و اندازه‌گیری تا 100 ماده روی هر باند نمونه‌گذاری و 36 باند روی هر صفحه؛
• اندازه‌گیری و تصحیح خط پایه به‌صورت خودکار؛
• گزارش و نمایش داده‌های طیفی تمام پیک‌ها به‌صورت داده گرافیکی توسط نرم‌افزار [1].

شکل 7: اسکنر صفحات کروماتوگرافی لایه نازک [1]

5- دستگاه پیشرفته TLC-MS

اتصال دو روش دستگاهی TLC و Mass باعث می‌شود تا امکانات جدیدی با توجه به توانایی هر دو دستگاه در دسترس کاربران باشد. محدودیت این دستگاه آنالیز، حد تشخیص پایین و ناخالصی در محدوده فرابنفش و پیچیدگی ماتریکس و عدم سازگاری MS با حلال است. دستگاه HPTLC به سادگی توانایی جداسازی نمونه‌ها را از هم دارد.
در دستگاه‌های قدیمی‌تر، نمونه بعد از جداسازی توسط TLC از روی صفحه خراشیده، در حلال حل شده و به دستگاه MS تزریق می‌شد، اما در دستگاه‌های جدید با استفاده از بخش حد واسط TLC-MS (تصویر 8)، امکان نمونه‌برداری مستقیم از سطح صفحات TLC در کمتر از یک دقیقه و انتقال آن به طیف‌سنج جرمی فراهم شده‌است [1].
ویژگی‌های TLC-MS:

• سریع و بدون تداخل با نمونه‌های مجاور روی صفحه TLC؛
• انتقال ترکیبات جداسازی شده به طیف‌سنج جرمی؛
• شناسایی موادی را که حد تشخیص پایین در دیگر دستگاه‌های آنالیز دارند؛
• مصرف بسیار کم حلال [1].

شکل 8: دستگاه TLC-MS [1].

1-5- سازوکار دستگاه TLC-MS

حلال قطبی متانول به‌عنوان شوینده با استفاده از پمپ HPLC وارد دستگاه می‌شود و با هدایت لوله‌های موئین به قسمت پانچ شده صفحه TLC وارد و بعد انحلال ترکیب مورد نظر طی فرایند کروماتوگرافی لایه نازک جداسازی شده، به قسمت خروجی سیستم هدایت و وارد بخش طیف‌سنج جرمی می‌شود. تصویر (9) نمایی از مراحل عملکرد دستگاه حد واسط TLC-MS را نشان می‌دهد [1].

شکل 9: نمایی از چگونگی عملکرد TLC-MS [1].

6- مستند سازی و ارزیابی با دستگاه TLC Visualizer

دستگاه TLC Visualizer (تصویر 10)، از صفحات TLC/HPTLC تحت تابش نور سفید مستقیم و فرابنفش 254 نانومتر و فلورسنت 366 نانومتر تصویربرداری می‌کند [1].

شکل 10: دستگاه TLC Visualizer [1].

1-6- ویژگی‌های دستگاه TLC Visualizer

• بهینه‌سازی منابع نوری، بهبود و نوردهی همگن؛
• بهینه‌سازی خودکار تصاویر در تمام حالت‌های نوری و اطمینان از تکرارپذیری که مبنای مقایسه تصاویر قرار می‌گیرد؛
• ثبت تصاویر از صفحات تحت تابش طول موج متفاوت و ذخیره آن در یک فایل؛
• امکان تنظیمات روشنایی و تصحیح رنگ به‌صورت دستی با استفاده از نرم‌افزار؛
• امکان مقایسه تصاویر با تصویر دیگر برای ارزیابی کمی نمونه‌ای گیاهی با نرم‌افزار Video Scan؛
• مقایسه تصویری باندهای منتخب از صفحات مختلف با هم.

این دستگاه به‌عنوان یک اسکنر به همراه برنامه نرم‌افزاری، امکان مقایسه تصاویر و گروه‌بندی همه ردیف‌های نمونه از صفحات مختلف را در کنار هم فراهم می‌کند و با مقایسه آن با ردیف استاندارد از روی صفحات مختلف برای اندازه‌گیری کمی در نمونه‌های گیاهی استفاده می‌شود. در تصویر (20)، نمونه‌های جداسازی شده با استفاده از نور سفید، ماورا بنفش و فلورسنت با استفاده از TLC Visualizer نشان داده شده‌است [1].

شکل 11: تصاویر نمونه‌های جداسازی شده با استفاده از نور سفید، ماورا بنفش و فلورسنت با استفاده از TLC Visualizer [1].

7- دستگاه تشخیص لومینسانس زیستی

دستگاه تشخیص لومینسانس زیستی (تصویر 12)، دستگاهی نوین به‌منظور تحقیق در زمینه‌های تعیین سریع پروفایل سمیت و آنالیز سریع فاضلاب صنایع غذایی است.

شکل 12: دستگاه تشخیص لومینسانس زیستی [1].

روش کار این دستگاه به این صورت است که مخلوط پیچیده زیستی، ابتدا به اجزاء سازنده با استفاده از دستگاه HPTLC جداسازی می‌شود و سپس در مایع سوسپانسیون لومینسانس باکتریایی غوطه‌ور شده و واکنش در مدت زمان کوتاهی انجام می‌شود. مناطق با اثر مهارکنندگی یا سمیت به‌صورت لکه‌های سیاه نمایان می‌شود که نشان‌دهنده مرگ باکتری و در نتیجه از بین رفتن ویژگی لومینسانس زیستی است (تصویر 13) [1].

شکل 13: بررسی فرآیند تخریب مواد فعال زیستی در نمونه‌های تصفیه فاضلاب با استفاده از دستگاه تشخیص لومینسانس زیستی [1].

در جدول (1) به کاربردهای دستگاه HPTLC اشاره شده‌است [1].

جدول 1: کاربردهای دستگاه HPTLC

شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات گیاهی بررسی پایداری فرآورده‌ای گیاهی کنترل تقلب در فرآورده‌های گیاهی		گیاهی (فیتوشیمی)
کنترل کیفی و کمی فرآیند در صنایع دارویی کنترل کیفی و کمی محتویات محصولات دارویی بررسی پایداری محصولات دارویی		دارویی
کنترل درستی محتویات مواد غذایی کنترل مواد افزودنی در مواد غذایی کنترل سموم در مواد غذایی		مواد غذایی
کنترل مواد اولیه در صنایع آرایشی و بهداشتی کنترل مواد افزودنی در محصولات آرایشی و بهداشتی کنترل تقلب در محصولات آرایشی و بهداشتی		آرایشی و بهداشتی
مطالعات متابولیسم داروها کنترل و شناسایی مواد مخدر کنترل و شناسایی مواد نیروزا		بالینی (کلینیکال)
تشخیص اسناد جعلی بررسی مسمومیت‌ها تجزیه و تحلیل مواد غیرمجاز		پزشکی قانونی
نظارت بر روند فرآیندهای شیمیایی بهینه‌سازی فرآیندهای شیمیایی کنترل و سنجش تمیز کردن تجهیزات فرآیندهای شیمیایی		صنایع شیمیایی

8- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی

این مقاله از مجموعه مقالات فصل نامه شبکه آزمایشگاهی فناوری‌های راهبردی سال 2017، شماره 16 برگرفته شده است. برای دسترسی به مراکز خدمات دهنده آنالیز HPTLC و TLC بر روی لینک زیر کلیک کنید [8].

نام دستگاه

دستگاه کروماتوگراف لایه نازک

دستگاه کروماتوگراف لایه نازک با کارایی بالا

9- نتیجه‌گیری

روش کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، با موفقیت به کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، طیف‌سنجی جرمی، طیف‌بینی مادون قرمز انتقال فوریه، فرابنفش و رامان پیوند داده شده‌است تا امکان کسب داده‌های دقیق‌تر، از ترکیبات جدا شده را فراهم سازد. کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا در مقایسه با سایر روش‌های کروماتوگرافی به ویژه در آنالیز اولیه مواد و تعیین پروفایل محتویاتشان قابل دسترس‌تر و ارزان‌تر است.
بی‌شک کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا به‌عنوان یک روش جداسازی مدرن با گستره‌ی کاربرد وسیع، هنوز هم پتانسیل زیادی برای پیشرفت‌های آینده در زمینه پژوهش دارا بوده و این فقط سر آغاز راه است.

منابـــع و مراجــــع

۱ – www.camag.com

۲ – antoine.frostburg.edu

۳ – www.hptlc.com

۴ – www.bio-rad.com

۵ – HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants (Eike Reich, Anne Schibli – Thieme Medical Publishers, Inc 2007)

۶ – Thin-layer Chromatography A Modern Practical Approach

۷ – High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC) (Man Mohan Srivastava – Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2011)

۸ – فصل نامه شبکه آزمایشگاهی فناوری‌های راهبردی سال 2017 و شماره 16