کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا-بخش اول

این مقاله شامل سرفصل‌های زیر است:
1- مقدمه
2- تعریف کروماتوگرافی
3- روش‌های کروماتوگرافی
1-3- کروماتوگرافی لایه نازک
1-1-3- کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا
2-1-3- مزایا و قابلیت‌های دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا
4- مقایسه روش‌های کروماتوگرافی
5- فرآیند کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا
6- فرآیند نمونه‌گذاری
1-6- انواع دستگاه‌های نمونه‌گذاری در کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا
7- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی
8- نتیجه‌گیری

اصول فرآیند کروماتوگرافی لایه نازک در طول 50 سال گذشته بدون تغییر باقی مانده است و شامل استفاده از یک لایه نازک از ماده‌ای جاذب به ضخامت 0/1 تا 0/25 میلی‌متر است که روی صفحاتی از جنس پلاستیک، آلومینیوم و یا شیشه به‌عنوان نگهدارنده این لایه جاذب استفاده می‌شود.
نمونه در یک حلال مناسب حل شده و به‌صورت لکه یا باند در فاصله یک سانتی‌متری لبه پایینی جاذب روی صفحات کروماتوگرافی لایه نازک گذاشته می‌شود. حلال شوینده (یک حلال یا مخلوطی از حلال‌ها) با ویژگی مویینگی از طریق جاذب و پایین‌تر از محل نمونه‌گذاری روی لایه جاذب حرکت می‌کند. این کار با استفاده از تانک شیششه‌ای مستطیل شکل انجام می‌گیردکه حلال شوینده به عمق 5 میلی‌متر درون آن ریخته می‌شود و پس از قرار گرفتن صفحه در آن، درب تانک گذاشته می‌شود. زمانی که حلال شوینده رو به بالا و از میان جاذب عبور می‌کند، اجزای نمونه نیز با سرعت‌های متفاوت مهاجرت می‌کنند و در نتیجه از یکدیگر جدا می‌شوند. هنگامی که حلال شوینده به نقطه‌ای نزدیک انتهای صفحه جاذب رسید، صفحه از درون تانک خارج و خشک می‌شود.
از ویژگی‌های این روش که آن را از سایر روش‌های جداسازی فیزیکی و شیمیایی متمایز نموده این است که دو فاز غیرقابل اختلاط، یکی ثابت و دیگری متحرک در تماس با یکدیگر قرار دارند. هنگامی که نمونه روی فاز ساکن قرار می‌گیرد با عبور فاز متحرک از میان نمونه و در طول فاز ثابت، اجزا نمونه، پیوسته تحت تعامل فیزیکی و شیمیایی گذرا با فاز ثابت و متحرک هستند و به تدریج در طول فاز ثابت از یکدیگر فاصله گرفته و به‌صورت باند یا مناطقی مشخص جداسازی می‌شوند.
لکه‌ها یا نوارهای جداسازی شده، با استفاده از نور فرابنفش و درصورت لزوم با معرف‌های شیمیایی مشتق‌سازی شده قابل رویت می‌شوند. برای اندازه‌گیری کمی، می‌توان ناحیه حاوی لکه را از روی صفحه جدا نمود و یا شستشو داد و یا با طول موج از پیش تعیین شده، بدون تخریب صفحه آن را اسکن نمود. روش‌های جدید کروماتوگرافی لایه نازک، حرکت رو به رشدی را در جهت اسکن و تصویربرداری از صفحات، به‌منظور حساسیت بیشتر و ثبت دقیق‌تر و ماندگارتر کروماتوگرام، آغاز نموده است که در آن علاوه‌بر کاهش نیروی کار، کاهش مواد شیمیایی (کاهش آلایندگی) نیز مورد توجه است [6].

کروماتوگرافی یکی از روش‌های جداسازی اجزای مخلوط است که در آن از اختلاف توزیع اجزا، بین فاز ساکن و متحرک (فاز ساکن به‌طور معمول، سیلیس یا آلومین) استفاده می‌شود. تصویر (1) قیاسی ساده برای کروماتوگرافی است بدین ترتیب که زنبورها مانند اجزاء نمونه، جذب گل‌ها می‌شوند و در نتیجه با سرعت و در زمان‌های متفاوت عبور می‌کنند [2].

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان ابتدا بر حسب ماهیت فاز متحرک و سپس بر حسب ماهیت فاز ساکن طبقه‌بندی کرد. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع و فاز ساکن ممکن است جامد یا مایع باشد. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد آن را کروماتوگرافی تقسیمی می‌نامند [5].

جدول 1: طبقه‌بندی روش‌های کروماتوگرافی ( بر حسب ماهیت فازها) [5].

براساس ماهیت فاز متحرک		براساس شکل یا جنس فاز ساکن
کروماتوگرافی گازی	کروماتوگرافی مایع	کروماتوگرافی کاغذی	کروماتوگرافی لایه نازک	کروماتوگرافی ستونی

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع بوده که اصول آن همانند کروماتوگرافی ستونی است. اما در این مورد، جسم جاذب جامد را به‌صورت یک لایه نازک روی یک قطعه شیشه، پلاستیک یا فلز پخش می‌کنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه می‌گذارند و صفحه را به همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار می‌دهند. سطح حلال باید آنقدر باشد که فقط به زیر لکه برسد. حلال براساس ویژگی مویینگی به سمت بالای صفحه حرکت می‌کند و اجزاء مخلوط را با سرعت‌های متفاوت با خود می‌برد. تصویر (2) چگونگی جداسازی اجزای نمونه روی صفحات کروماتوگرافی لایه نازک را نشان می‌دهد [6].

کروماتوگرافی لایه نازک بسیار آسان است و به سرعت هم انجام می‌شود. این روش برای تفکیک اجزاء مخلوط بسیار کارآمد بوده و همچنین می‌توان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده به‌منظورکروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.
در کروماتوگرافی لایه نازک می‌توان از همان مواد جامدی که در کروماتوگرافی ستونی استفاده می‌شود، به‌عنوان فاز ساکن استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار می‌رود. به‌طور معمول، جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده چسباننده مانند گچ، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط می‌کنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه‌ها را می‌توان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه‌های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است، استفاده نمود [6].

دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، برتری‌هایی بر کروماتوگرافی لایه نازک دارد که شامل موارد زیر است [7]:

همچنین این دستگاه قادر به بررسی و تحقیق در مورد اطلاعات حاصل از ترکیبات پیچیده آلی، معدنی و مولکول‌های زیستی است. در تصاویر (3) و (4) کیفیت نتایج حاصل از جداسازی نمونه‌ها به دو روش کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، در مورد نمونه‌های یکسان، قابل مشاهده است.

کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا دارای مزایایی است که از آن جمله می‌توان به موارد زیر اشاره نمود [7]:

بین سه روش کروماتوگرافی HPTLC، HPLC و GC مقایسه‌ای صورت گرفته است که مزایا و معایب هر کدام از آنها در جدول ذیل آمده است:

جدول 2: مقایسه روش‌های کروماتوگرافی [7]

کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، فرم بهبود یافته کروماتوگرافی لایه نازک است که با انجام خودکار مراحل کروماتوگرافی باعث افزایش تفکیک‌پذیری و اندازه‌گیری کیفی و کمی با دقت و صحت بالاتری می‌شود. تصویر (5) نمایی از مراحل انجام فرایند کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا را نشان می‌دهد [1].

نمونه‌گذاری اولین گام در فرآیند کروماتوگرافی لایه نازک است و تأثیر قابل توجهی بر کیفیت نتایج پایانی دارد. در کروماتوگرافی لایه نازک، نمونه‌گذاری به‌صورت دستی و توسط لوله موئین برای آنالیزهای ساده انجام می‌شود. به‌وسیله لوله موئین می‌توان حجمی بین 5 تا 0/5 میکرولیتر را روی صفحات معمولی به‌صورت لکه، نمونه‌گذاری کرد.
در آنالیزهای کیفی و کمی به‌منظور افزایش قدرت تفکیک و تکرارپذیری، نمونه‌گذاری به‌صورت باند با استفاده از دستگاه نمونه‌گذار خودکار انجام می‌پذیرد [1].
نمونه‌گذاری در حالت اسپری کردن، به‌صورت نوار باریک، این امکان را فراهم می‌سازد تا بتوان حجم بیشتری را در گستره وسیع‌تر روی صفحات قرار داد؛ به ویژه هنگامی که به‌منظور ردیابی آنالیت، باید حجم بیشتری نمونه‌گذاری شود و یا هنگامی که ماتریکس نمونه پیچیده است، برای قدرت تفکیک بهتر، باید در وسعت زیادتری نمونه‌گذاری نمود. در تصویر (6) نمونه‌گذاری به‌صورت لکه و باند روی صفحات کروماتوگرافی لایه نازک و نتایج جداسازی حاصل از چگونگی نمونه‌گذاری به خوبی نشان داده شده‌است [1].

با استفاده از نمونه‌گذار دستی (تصویر 7)، نمونه‌گذاری به آسانی و با دقت بالا و بدون صدمه به لایه به‌وسیله این دستگاه به‌صورت لکه روی صفحات HPTLC و TLC انجام می‌شود. همچنین حجم نمونه‌گذاری نیز به مقدار یکسان مطابق ظرفیت لوله موئین استاندارد، با استفاده از نگهدارنده لوله موئین، انجام می‌شود [1].

این دستگاه نمونه‌گذاری، نیمه خودکار بوده و برای آنالیز کیفی و کمی و نیز در جداسازی تهیه‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد و ابزار مناسبی برای کاربردهای عمومی در نمونه‌گذاری است و در مقایسه با نمونه‌گذاری خودکار نیاز به حضور کاربر دارد [1].
نمونه‌گذاری به‌صورت باندهای باریک است و برای نمونه‌گذاری با حجم بیشتر و تفکیک‌پذیری بهتر، از روش اسپری کردن استفاده می‌شود. این دستگاه تحت کنترل نرم‌افزار است. تصویر (8) نمایی از نمونه‌گذار نیمه خودکار را نشان می‌دهد [1].

استفاده از دستگاه نمونه‌گذار خودکار (تصویر 9)، عاملی کلیدی در افزایش بهره‌وری در آزمایشگاه HPTLC است. مزایایی مانند دقت و توانایی انجام کار در استفاده طولانی مدت را می‌توان در دستگاه نمونه‌گذاری خودکار مشاهده نمود [1].
از توانایی‌های این دستگاه می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

 7- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی

روش کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا، با موفقیت به کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، طیف‌سنجی جرمی، طیف‌بینی مادون قرمز انتقال فوریه، فرابنفش و رامان پیوند داده شده‌است تا امکان کسب داده‌های دقیق‌تر، از ترکیبات جدا شده را فراهم سازد. کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا در مقایسه با سایر روش‌های کروماتوگرافی به ویژه در آنالیز اولیه مواد و تعیین پروفایل محتویاتشان قابل دسترس‌تر و ارزان‌تر است.
بی‌شک کروماتوگرافی لایه نازک با عملکرد بالا به‌عنوان یک روش جداسازی مدرن با گستره‌ی کاربرد وسیع، هنوز هم پتانسیل زیادی برای پیشرفت‌های آینده در زمینه پژوهش دارا بوده و این فقط سر آغاز راه است.