مقدمه‌ای بر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

پیشرفت‌های اخیری که در فناوری ساخت ستون‌های کروماتوگرافی، بهینه‌سازی دستگاه، طراحی آشکارساز و آنالیز داده‌ها رخ داده است، توسعه چشمگیری را در زمینه کروماتوگرافی به همراه داشته است.
کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده زمینه‌ای جدید در علم جداسازی است که علاوه‌بر حفظ اصول کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، سه قابلیت سرعت، حساسیت و تفکیک را به میزان قابل توجهی بهبود داده‌است. در دستگاهی که از این فناوری استفاده می‌کند، از ذرات ریزتری نسبت به HPLC (کمتر از µm2.5) استفاده می‌شود؛ بنابراین طول ستون کاهش پیدا کرده، آنالیز در زمان کوتاه‌تری انجام می‌شود و مصرف حلال نیز کاهش می‌یابد.

این مقاله شامل سرفصل‌های زیر است:
1- مقدمه
2- شیمی ذرات پُر کننده ستون
3- دستگاهوری
4- کاربردهای کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده
1-4-افزایش سرعت آنالیز و تفکیک پیک‌ها
2-4- آنالیز ترکیبات طبیعی و داروهای گیاهی
3-4- مطالعه‌های آنالیز زیستی
4-4- تشخیص میزان ناخالصی‌ها
5-4- معایب
6- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی

7-نتیجه‌گیری

1- مقدمه

در طی سی سال گذشته تا به امروز، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از عمده‌ترین فناوری‌های کروماتوگرافی به کار رفته در آزمایشگاه‌های سراسر جهان است و یکی از دلایل گسترش این روش، پیشرفت ساخت مواد پرکننده ستون‌های کروماتوگرافی است که تأثیر عمده‌ای بر جداسازی دارد. از عمده‌ترین محدودیت‌های HPLC، کارایی نداشتن در مقایسه با کروماتوگرافی گازی یا الکتروفورز مویین به علت ضریب توزیع پایین در فاز مایع است که نفوذ آنالیت در فاز ساکن را آهسته می‌سازد. اساس UPLC استفاده از فاز ساکن با اندازه ذراتی کمتر از µm2 است در برابر HPLC که اندازه ذرات آن بین µm5-3 است.
تأثیر ذرات پرکننده ستون را می‌توان با معادله وان دیمتر توضیح داد که برای تمام کسانی که اصول کروماتوگرافی را می‌دانند آشناست [1]. معادله وان دیمتر فرمولی تجربی است که رابطه میان سرعت خطی (سرعت جریان) و ارتفاع بشقابک (کارایی ستون) را نشان می‌دهد. از آنجایی که اندازه ذرات یکی از متغیرهاست، منحنی وان دیمتر را می‌توان برای بررسی کارایی کروماتوگرافی به کار برد (شکل 1). معادله وان دیمتر با سه جزء، نشان می‌دهد که محدوده سرعت جریان برای کارایی خوب با قطر ذرات کوچکتر بسیار بیشتر از این محدوده برای ذرات بزرگتر است [2 و 3].

H=A+B/U+CU

که در این معادله A، B و C ثابت هستند و U: سرعت خطی است. ثابت A، مستقل از سرعت و بیانگر نفوذ گردابی است. این عبارت زمانی که مواد پرکننده ستون کوچک و یکنواخت هستند در حداقل مقدار خود است. ثابت B، تمایل نفوذ طبیعی مولکول‌های نمونه را نشان می‌دهد. این اثر در سرعت‌های بالا حذف می‌شود و به همین دلیل بر سرعت جریان (U) تقسیم می‌گردد. منشأ ثابت C، مقاومت سینتیکی در برابر تعادل در فرآیندهای جداسازی است. مقاومت سینتیکی، تأخیر در حرکت از فاز متحرک به فاز ساکن و برعکس است. هرچه سرعت جریان فاز متحرک بیشتر باشد، مولکول روی فاز ساکن تمایل بیشتری به تأخیر نسبت به مولکولی دارد که در فاز متحرک است و به همین دلیل این ثابت متناسب با سرعت جریان (U) است.
معادله وان دیمتر نشان می‌دهد که با ذرات کوچک‌تر، کارایی بهبود می‌یابد اما در عین حال، ذرات کوچک‌تر منجر به فشار برگشتی بالاتر هم می‌شوند و این در حالی است که اغلب دستگاه‌های HPLC تنها تا فشار bar400 کار می‌کنند. به همین دلیل می‌توان دریافت که چرا با ذراتی کوچکتر از µm2، ستون‌های کوتاه‌تری به کار می‌رود؛ زیرا تنها در این صورت است که سرعت آنالیز بدون از دست دادن کارایی افزایش می‌یابد. بنابراین امکان افزایش ظرفیت و سرعت آنالیز بدون تأثیر بر کارایی کروماتوگرافی وجود دارد. ظهور UPLC به توسعه دستگاه کروماتوگرافی مایع که در آن حجم مرده باید کاهش یابد و مقاومت در برابر فشاری معادل psi15000 تا 8000 وجود داشته باشد، منجر شده‌است. کارایی، متناسب با اندازه ذره و به‌طور معکوس متناسب با طول ستون است. به همین دلیل ستون به همان نسبتی که اندازه ذره کاهش می‌یابد کوتاه‌تر می‌شود.

شکل 1: منحنی وان دیمترکه سیر تکاملی اندازه ذره را در طی سه دهه گذشته نشان می‌دهد.

بر پایه تئوری HPLC، هرچه اندازه مواد پرکننده ستون کاهش یابد، کارایی و تفکیک هر دو افزایش می‌یابد. شکل (1) نشان می‌دهد زمانی که اندازه ذره به کمتر از µm5/3 می‌رسد نه تنها کارایی بسیار بالایی به‌دست می‌آید، بلکه این کارایی در سرعت جریان‌های بالا هم از دست نمی‌رود. با به کار بردن ذرات کوچک‌تر، سرعت و ظرفیت پیک (تعداد پیک‌های جداسازی شده در واحد زمان) را می‌توان به مرز جدیدی رساند که کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده یا UPLC نامیده می‌شود. با استفاده از UPLC اکنون این امکان وجود دارد که با استفاده از ستون‌های کوتاه‌تر و یا سرعت جریان‌های بالاتر – به‌منظور دستیابی به سرعت‌های بالاتر با تفکیک و حساسیت بسیار بیشتر – از تمامی توان کروماتوگرافی، برای جداسازی بهره برد. مفهوم UPLC را به‌صورت ملموس‌تری می‌توان در شکل (2) مشاهده نمود که جداسازی پنج ترکیب در یک مخلوط را با HPLC و UPLC مقایسه می‌کند. کروماتوگرام پایین، گسترده 0/6 دقیقه ابتدایی کروماتوگرام همپوشان بالاست که افزایش سرعت جداسازی در UPLC را نشان می‌دهد.

شکل 2: کروماتوگرام بالایی، کروماتوگرام همپوشان HPLC معمولی (µm3) و UPLC (µm1/7) است.

2-شیمی ذرات پُر کننده ستون

طراحی و توسعه ذرات کوچک‌تر از µm2 چالشی اساسی است و تحقیقات وسیعی به‌وسیله محققین در این زمینه انجام می‌شود [4]. اگر چه ذرات غیرمتخلخل کارآمدی با اندازه µm1/5 به‌صورت تجاری وجود دارند ولی این ذرات دارای مساحت سطح کمی هستند که این امر منجر به ظرفیت بارگذاری و بازداری کمتری می‌شود. برای حفظ ظرفیت و بازداری مشابه HPLC، روش UPLC باید از ذرات جدید متخلخلی استفاده کند که قادر به تحمل فشارهای بالا باشد. ذرات بر پایه سیلیکا، قدرت مکانیکی خوبی دارند اما دارای معایبی نیز هستند. از جمله این معایب می‌توان به دنباله‌دار شدن آنالیت‌های بازی و قابلیت کاربرد در محدوده کوچکی از pH اشاره نمود. جایگزین دیگر، ستون‌های پلیمری هستند که در pHهای وسیع‌تری عمل می‌کنند اما آن‌ها نیز معایبی چون کارایی پایین و ظرفیت‌های محدود دارند.
در سال 2000 کمپانی واترز اولین نسل ستون هیبریدی را به نام ایکس‌ترا معرفی نمود که مزایای هر دو ستون‌های سیلیکایی و پلیمری را دارا بود. این نوع ستون‌ها قدرت مکانیکی بالاتر و همچنین عملکرد، در محدوده وسیع‌تری از pH را دارا بودند. ستون‌های ایکس‌ترا به کمک سنتز کلاسیک سل‌ژل سنتز می‌شوند که کربن را به فرم متیل وارد ساختار می‌کنند. البته به‌منظور فراهم آوردن قدرت مکانیکی مورد نیاز برای دستگاه UPLC نسل دوم فناوری هیبریدی معرفی شد که آن را ACQUITY UPLC نام‌گذاری کردند [5]. ذرات ACQUITY با اندازه µm1/7 ، گروه‌های متیل را در ماتریکس سیلیکا همان‌طور که در شکل (3) مشاهده می‌شود، از طریق پل به هم متصل می‌کند که این امر باعث افزایش پایداری مکانیکی ذرات می‌شود.

شکل 3: شیمی و سنتز ستون‌های ACQUITY با اندازه µm1/7

چهار فاز ساکن ACQUITY برای جداسازی‌های UPLC وجود دارد که عبارتند از:
1. (ستون‌های با زنجیر آلکیل مستقیم) ACQUITY UPLC^TM BEH C18؛
2. (ستون‌های با زنجیر آلکیل مستقیم) C8 ACQUITY UPLC^TM BEH؛
3.(ستون‌های با گروه‌های قطبی) ACQUITY UPLC BEH Shield RP18؛
4. گروه فنیل از طریق یک زنجیر 6 کربنی به گروه سیلیل وصل شده‌است ACQUITY UPLC BEH Phenyl.
هر ستون، تلفیقی از فاکتورهای متفاوتی چون آبگریزی، فعالیت سیلانول، پایداری هیدرولیتیکی و برهم‌کنش شیمیایی با آنالیت به‌دست می‌دهد (شکل 4).

شکل 4: شیمی ستون‌های ACQUITY UPLC BEH

ستون‌های نوع (1) و (2) ذکر شده در بالا، ستون‌های فراگیر برای اغلب مقاصد جداسازی با UPLC هستند که محدوده pH وسیعی را نیز فراهم می‌آورند. در این نوع ستون‌ها، شیمی پیوندهای لیگاندهای سه عاملی باعث پایداری اندک در pHهای پایین می‌شود. این پایداری کم در pHهای پایین با پایداری در pHهای بالای ذرات 1/7 میکرومتری BEH ادغام می‌شود و ستون‌هایی با پایداری در محدوده pH بالاتری را به‌دست می‌دهند. ستون‌های نوع (3) گزینش پذیری‌هایی را فراهم می‌آورند که مکمل ستون‌های نوع (1) و (2) است. ستون‌های نوع (4) مذکور، از گروه آلکیل 6 کربنه سه عاملی میان حلقه فنیل و گروه عاملی سیلیل بهره می‌گیرند. این لیگاند طول عمر ستون را افزایش داده، شکل پیک‌های بسیار عالی به‌دست می‌دهد. قطر داخلی ستون به‌طور معمول 1/2 میلی‌متر است. برای رسیدن به ماکزیمم تفکیک، طول ستون mm100 و برای آنالیز سریع‌تر، طول ستون mm50 مناسب‌تر است.
پر کردن ستون با ذراتی با اندازه µm1/7 به شیوه‌ای تکرارپذیر نیز چالشی است که باید بر آن فائق آمد. ستون‌های ساخته شده باید سطح داخلی هموارتری داشته باشند و کلیه اجزای آن به‌گونه‌ای طراحی شوند که از مسدود شدن ستون جلوگیری شود. یکنواختی ستون هم به ویژه برای ستون‌های کوتاه‌تر برای حفظ تفکیک در عین جداسازی سریع‌تر، شایان اهمیت است.

3- دستگاهوری

به‌طور کلی برای دستگاه‌های UPLC با فناوری‌های‌های پیشرفته، پمپ، تزریق‌کننده خودکار، آشکارساز و سیستم داده نیز باید طراحی شود. از آنجایی که ذرات پرکننده ستون کوچک‌تر هستند، برای رسیدن به جداسازی با ظرفیت پیک بالاتر نسبت به HPLC‌های متداول امروزی، محدوده فشار بیشتری نیز باید اعمال شود. افت فشار محاسبه شده در سرعت جریان بهینه و ماکزیمم کارایی در یک ستون 15 سانتی‌متری با ذرات µm1/7 معادل psi15000 است. بنابراین پمپی لازم است که قادر باشد حلال را به‌صورت یکنواخت و تکرارپذیر، در این فشار از ستون بگذراند.
وارد کردن نمونه به درون ستون نیز یک عامل مهم و اساسی است. تزریق‌کننده‌های دستی و یا اتوماتیک کنونی برای عمل در چنین فشارهای بالایی طراحی نشده‌اند. برای حفظ ستون از نوسان‌های فشار، تزریق باید حتی‌الامکان بدون پالس باشد. حجم حلال شوینده نیز باید در حداقل مقدار خود باشد تا از پهن شدن باند جلوگیری شود. زمان تزریق سریع در دستگاه UPLC برای قرار گرفتن در مقیاس سرعت فراهم آمده از مواردی است که باید مورد توجه قرار گیرد. حجم تزریق کم و حجم حلال کم از عوامل ایجاد کننده حساسیت بالا در UPLC است.
با ذراتی به قطر µm1/7 عرض پیک در نیمه ارتفاع آن کمتر از یک ثانیه خواهد بود و این مسئله برای آشکارساز نیز چالش مهمی است. برای داشتن پیک‌های استاندارد با تکرارپذیری بالا، آشکارساز باید سرعت کافی داشته باشد تا در هر لحظه تعداد داده بیشتری را ثبت نماید. در نتیجه حساسیت روش UPLC بسته به قدرت تفکیک آشکارسازها دو تا سه برابر بیشتر از جداسازی HPLCهای متداول خواهد بود. جدول (1) مقایسه‌ای میان مشخصات دو دستگاه HPLC و UPLC را نشان می‌دهد.

جدول 1: مقایسه میان دستگاه‌های UPLC و HPLC

مشخصات	HPLC	UPLC
اندازه ذره	µm5-3	کمتر از µm2
ماکزیمم فشار برگشتی	MPa40-35	103/5MPa
ستون تجزیه‌ای	Alltima C18	Acquity UPLC BEH C18
ستون	mm3/2 × 150	mm2/1 × 150
دمای ستون	C˚30	C˚65
حجم تزریق	lµ5	lµ2

4- کاربردهای کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده

1-4-افزایش سرعت آنالیز و تفکیک پیک‌ها

افرادی که از روش کروماتوگرافی استفاده می‌کنند اغلب تفکیک را قربانی سرعت می‌کنند. UPLC بر این مشکلات غلبه می‌کند. در شکل (5) جداسازی هشت ترکیب به ترتیب پیک‌ها، استازولامید، هیدروکلروتیازید، ناخالصی، هیدروفلومتیازید، کلوپامید، تری کلرمتیازید، اینداپامید، بندرو فلومتیازید و اسپیرونولاکتون (هر کدام غلظت mg/ml0/1 در آب) با UPLC در کمتر از 1/6 دقیقه نشان داده شده‌است در حالی که جداسازی مشابهی در ستون با قطر 2/1 و طول 100 میلی‌متر با ستون C18 و قطر ذرات mµ5 با تفکیک مشابه در مدت ده دقیقه انجام شده‌است.

شکل 5: جداسازی هشت ترکیب با  UPLCبا شرایط آنالیز زیر:
ستون قطر 2/1 میلی‌متر، طول 30 میلی‌متر ذرات پرکننده ACQUITY UPLC C18 با قطر µm7/1 در دمای 35 درجه سانتی‌گراد. گرادیان 45-9درصد در گرادیان خطی در طی 0/8 دقیقه در سرعت جریان ml/min0/86  فاز متحرک A (0/1 درصد فرمیک اسید)، B (استونیتریل). آشکارسازی UV در nm273

اما برای برخی آنالیزها، سرعت در درجه دوم اهمیت قرار دارد و ظرفیت پیک و تفکیک است که اولویت دارد. شکل (6) جداسازی پپتیدها را نشان می‌دهد که هدف اصلی، به حداکثر رساندن تعداد پیک‌ها است. در این کاربرد ظرفیت پیک (تعداد پیک‌های تفکیک شده در هر دقیقه) در UPLC به طور چشمگیری افزایش می‌یابد.

شکل 6: ظرفیت پیک HPLC در مقابل UPLC
در شکل (6)، جداسازی پپتیدها با استفاده از HPLC و ستون C18 و ذرات µm5 را نشان می‌دهد که هفتاد پیک با ظرفیت پیک 143 را به‌دست می‌دهد، در حالی که در طیف پایین که جداسازی پپتیدها با UPLC انجام شده‌است، نتیجه 168 پیک با ظرفیت پیک 360 (2/5 برابر افزیش) را به‌دست می‌دهد.

2-4- آنالیز ترکیبات طبیعی و داروهای گیاهی

UPLC به‌طور گسترده‌ای برای آنالیز ترکیبات طبیعی و داروهای گیاهی به کار می‌رود. آزمایشگاه‌های تجزیه‌ای برای ارائه شواهد مبتنی بر اثر بخشی یک دارو و همچنین فراهم آوردن عوامل ایمنی برای محصولات، نیاز به افزایش دانش خود در زمینه فارماکولوژی دارند. هدف عمده در این زمینه، آنالیز نمونه‌های دارویی در یک ماتریکس پیچیده است. UPLC امکان جداسازی و شناسایی ترکیبات فعال در نمونه‌های بسیار پیچیده حاصل از ترکیبات طبیعی و داروهای گیاهی را فراهم می‌آورد.

3-4- مطالعه‌های آنالیز زیستی

به‌منظور مطالعات سم‌شناسی و فارماکوکنیتیکی، تعیین مقدار یک دارو در نمونه‌های بیولوژیکی بخش مهمی از مطالعه‌ها را تشکیل می‌دهد. بیشتر داروها ترکیباتی با وزن مولکولی پایین هستند و در مطالعه‌های پیش‌کلینیکی و کلینیکی مورد آزمایش قرار می‌گیرند. ماتریس‌های متعدد بیولوژیکی برای آنالیزهای زیستی مقدارسنجی مورد استفاده قرار می‌گیرند که از جمله آن‌ها خون، پلاسما و ادرار است. روش اولیه در آنالیز زیستی کمی LC/MS/MS است. حساسیت و گزینش‌پذیری UPLC/MS/MS در سطوح آشکارسازی پایین، داده‌های دقیق و قابل اعتمادی را فراهم می‌آورد که برای مقاصد مختلفی از جمله آنالیزهای آماری فارماکوکینتیکی قابل استفاده هستند.

4-4- تشخیص میزان ناخالصی‌ها

در صنایع داروسازی و فرآیندهای فرمولاسیون، جداسازی و تعیین مقدار ترکیبات دارویی و ناخالصی‌های موجود در مواد خام و محصول نهایی، بخش عمده‌ای از تحقیقات را تشکیل می‌دهد. شناسایی مواد ناخالص با استفاده از کروماتوگرافی با تفکیک بالا، به جداسازی‌های قابل اعتماد، تکرارپذیر و تشخیص همه ناخالصی‌های شناخته شده در ترکیب فعال دارویی نیاز دارد.
همچنین تعیین مقادیر اندک ناخالصی در غلظت‌های بالای ترکیب فعال دارویی نیز بسیار مهم است. اگر چه این امر در حضور افزودنی‌ها در نمونه به ویژه در آنالیز با HPLCهای معمولی پیچیده‌تر می‌شود، اما UPLC تفکیک بالاتری را فراهم می‌آورد تا جداسازی و آشکارسازی مقادیر اندک ناخالصی امکان‌پذیر شود.

5-4- معایب UHPLC

قیمت دستگاه و تجهیزات در این شیوه از کروماتوگرافی بالاتر است. به علت افزایش فشار، نگهداری دقیق‌تری از اجزای دستگاه لازم بوده، همچنین طول عمر ستون در این روش کوتاه‌تر است. علاوه‌بر آن، فازهای ساکن کمتر از µm2 قابل بازیابی نیستند و به همین دلیل از این لحاظ مقرون به صرفه نیست [6 و 7]. در UPLC تنها از دو پمپ (و نه 3 یا 4 پمپ) می‌توان استفاده نمود. تعداد فازهای ساکن مورد استفاده در این دستگاه محدود بوده، گرچه سرعت ساخت فازهای ساکن جدید در حال پیشرفت است. از دیگر جنبه‌های منفی UPLC می‌توان به فشار برگشتی بالاتر از HPLC معمولی اشاره کرد که این فشار برگشتی را با بالا بردن دمای ستون می‌توان کاهش داد.

6- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی

این مقاله از مجموعه مقالات فصل نامه شبکه آزمایشگاهی فناوری‌های راهبردی سال 2013، شماره 1 برگرفته شده است. برای دسترسی به مراکز خدمات دهنده UHPLC  بر روی لینک زیر کلیک کنید.

نام دستگاه

کرماتوگراف مایع با کارایی بسیار بالا

7-نتیجه‌گیری

UPLC در دو زمینه شیمی و دستگاهوری پیشرفت‌های چشمگیری داشته و منجر به تفکیک، سرعت و حساسیت بالا در کروماتوگرافی مایع گردیده است. زمانی که بسیاری از محققان با موانعی در جداسازی با HPLC متداول روبرو می‌شوند، UPLC با توسعه و افزایش کارایی کروماتوگرافی امکان غلبه بر موانع را فراهم می‌کند. مزیت مهم UPLC کاهش زمان آنالیز است که متعاقباً مصرف حلال را کاهش می‌دهد. در کروماتوگرافی مایع، زمان آنالیز، مصرف حلال و قیمت تمام شده آنالیز در هر آزمایشگاه تجزیه‌ای حائز اهمیت است، لذا بهینه‌سازی روش، منجر به کاهش زمان برای به تعادل رسیدن ستون می‌شود. حساسیت را می‌توان با مطالعه عرض پیک در نیمه ارتفاع مقایسه کرد که حساسیت در UPLC بسیار بالاتر از HPLC معمولی است.

منابـــع و مراجــــع

۱ – F.K. Liu, Chromatographia 66 (2007) 791.

۲ – J.P.Wilcoxon, J.E. Martin, P. Provencio, Langmuir 16 (2000) 9912.

۳ – F.K. Liu, G.T.Wei, Chromatographia 59 (2004) 115.

۴ – G.T.Wei, F.K. Liu, J. Chromatogr. A 836 (1999) 253.

۵ – Y. Mori, M. Furukawa, T.Hayashi, K.Nakamura, Particul. Sci. Technol. 24 (2006)97.

۶ – P.M. Shiundu, S.M. Munguti, S.K.R. Williams, J. Chromatogr. A 983 (2003) 163.

۷ – J.C. Giddings, Science 260 (1993) 1456.

۸ – F.K. Liu, Chromatographia 66 (2007) 791.

۹ – F.K. Liu, G.T.Wei, Chromatographia 59 (2004) 115.

۱۰ – C.K. Lo, M.C. Paau, D. Xiao, M.M.F. Choi, Electrophoresis 29 (2008) 2330.

۱۱ – J.P.Wilcoxon, J.E. Martin, P. Provencio, J. Chem. Phys. 115 (2001) 998.

۱۲ – Y. Song, M.L.A.V. Heien, V. Jimenez, R.M.Wightman, R.W. Murray, Anal. Chem. 76 (2004) 4911.

۱۳ – Y. Song, V. Jimenez, C. McKinney, R. Donkers, R.W. Murray, Anal. Chem. 75 (2003) 5088.

۱۴ – V.L. Jimenez, M.C. Leopold, C. Mazzitelli, J.W. Jorgenson, R.W. Murray, Anal. Chem. 75 (2003) 199.

۱۵ – W. Bos, J.J. Steggerda, S. Yan, J.A. Casalnuovo, Inorg. Chem. 27 (1988) 948.

۱۶ – G. Schmid, ClustersColloids: Theory to Applica- tions, VCH, Weinhein, 1994.

۱۷ – A. Henglein, J. Phys. Chem. 97 (1993) 5457.

۱۸ – R.W. Devenish, T. Goulding, B.T. Heaton, R. Whyman, J. Chem. Soc., Dalton Trans. N5 (1996) 673.

۱۹ – K.A. Littau, P.J. Szajowski, A.R. Kortan, L.E. Brus, J. Phys. Chem. 97 (1993) 1224.

۲۰ – Ch.-F. Fischer, M. Giersigs, Langmuir 8 (1992) 1475.

۲۱ – T. Siebrands, M. Giersigs, P. Mulvaney, Ch.-F. Fischer, Langmuir 9 (1993) 2297.

۲۲ – J.J. Kirkland, J. Chromatogr. 185 (1979) 273.

۲۳ – Ch.-F. Fischer, M. Giersig, J. Chromatogr. A 688 (1994) 97.

۲۴ – Ch.-F. Fischer, M. Giersig, T. Siebrands, J. Chromatogr. A 670 (1994) 89.

۲۵ – A. Dass, R. Guo, J.B. Tracy, R. Balasubramanian, A.D. Douglas, R.W. Murray, Langmuir 24 (2008)

۲۶ – R.L.Wolfe, R.W. Murray, Anal. Chem. 78 (2006) 1167.

۲۷ – R. Balasubramanian, R. Guo, A.J. Mills, R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 8126.

۲۸ – V.L. Jimenez, D.G. Georganopoulou, R.J. White, A.S. Harper, A.J. Mills, D.I. Lee, R.W. Murray, Langmuir 20 (2004) 6864.

۲۹ – A.M. Al-Somali, K.M. Krueger, J.C. Falkner, V.L. Colvin, Anal. Chem. 76 (2004) 5903.

۳۰ – G.T. Wei, F-K. Liu, C.R.C. Wang, Anal. Chem. 71 (1999) 2085.

۳۱ – T. Okada, Anal. Chem. 60 )1988) 1511.

۳۲ – W. L. Hinze, In Ordered Media in Chemical Separation; Hinze, W. L., Armstrong, D. L., Eds.; ACS Symposium Series 342; American Chemical Society: Washington, DC, 1987; pp 2-82.

۳۳ – A. Berthod, I. Girard, C. Gonnet, In Ordered Media in Chemical Separation; Hinze, W. L., Armstrong, D. L., Eds.; ACS Symposium Series 342; American Chemical Society: Washington, DC, 1987; pp 130-141.

۳۴ – W. G. Tramposch, S.G. Weber, Anal. Chem. 58 (1986) 3006.

۳۵ – G.T. Wei, F-K. Liu, J. Chrom. A. 836 (1999) 253.

۳۶ – فصل نامه شبکه آزمایشگاهی فناوری‌های راهبردی سال 2013 و شماره 1