آموزش پیشرفتهآموزش نانو
روشهای کروماتوگرافی برای تخلیص پروتئینها -بخش دوم
دانش تخلیص پروتئین قدمتی نزدیک به یک قرن دارد. برای جداسازی یک پروتئین خاص از مخلوط، از ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی خاص آن پروتئین استفاده میشود. هیچ روش منحصر به فرد یا راه سادهای برای خالصسازی همه انواع پروتئینها وجود ندارد. روشها و شرایط اعمال شده در تخلیص میتواند باعث غیرفعال شدن پروتئینها شود. در این مقاله دو نوع از روشهای کروماتوگرافی متداول، کروماتوگرافی میل ترکیبی و کروماتوگرافی اندازه طردی مورد بحث قرار گرفته و مزایا، معایب و محدودیتهای هر روش مورد بحث قرار میگیرد.
این مقاله شامل سرفصلهای زیر است:
1- مقدمه
این مقاله شامل سرفصلهای زیر است:
1- مقدمه
2- کروماتوگرافی میل ترکیبی
1-2- فاز ساکن
2-2- لیگاندها
3-2- بازوی حایل
4-2- اتصال لیگاند
5-2- فاز متحرک
6-2- راهبرد شویش
3- کروماتوگرافی اندازه طردی
1-3- غربال مولکولی
2-3- فاز ساکن
3-3- فاز متحرک
1-3-3- راهبرد شویش
4-3- کاربردها
1-4-3- تعویض بافر
2-4-3- جزء به جزءسازی پروتئین
3-4-3- تعیین اندازه مولکولی
نتیجهگیری
1-2- فاز ساکن
2-2- لیگاندها
3-2- بازوی حایل
4-2- اتصال لیگاند
5-2- فاز متحرک
6-2- راهبرد شویش
3- کروماتوگرافی اندازه طردی
1-3- غربال مولکولی
2-3- فاز ساکن
3-3- فاز متحرک
1-3-3- راهبرد شویش
4-3- کاربردها
1-4-3- تعویض بافر
2-4-3- جزء به جزءسازی پروتئین
3-4-3- تعیین اندازه مولکولی
نتیجهگیری
1- مقدمه
هزاران نوع پروتئین با خواص و عملکردهای مختلف وجود دارند. برای مطالعه یک پروتئین باید فرم خالصی از آن را در اختیار داشت. برای خالصسازی پروتئین، روشهای جداسازی مختلفی بر حسب ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی پروتئین وجود دارد. کروماتوگرافی، روشی قدرتمند برای شناسایی و خالصسازی ترکیبات بیولوژیکی است. اصول جداسازی در کروماتوگرافی، توزیع و یا تفکیک مولکولها میان دو فاز امتزاج ناپذیر به نامهای فاز متحرک و فاز ساکن است. امروزه متداولترین روش شناسایی و خالصسازی مولکولهای بیولوژیک، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا است. همانگونه که در مقاله روشهای کروماتوگرافی برای تخلیص پروتئینها (قسمت اول)، ذکر شد؛ کروماتوگرافی تبادل یونی، کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفوبی، کروماتوگرافی اندازه طردی و کروماتوگرافی میل ترکیبی از جمله روشهای جداسازی با استفاده از روش کروماتوگرافی بهعنوان روشهای تخلیص پروتئینها هستند. در قسمت اول مقاله به دو روش نخست پرداخته شد و در مقاله حاضر، دو روش آخر مورد بحث قرار خواهد گرفت.
2- کروماتوگرافی میل ترکیبی
از جمله برهمکنشهای بیولوژیکی پروتئینها، برهمکنشهای ویژه آنها با دیگر مولکولهاست که لیگاند نامیده میشوند. این برهمکنشها با ترکیباتی با وزن مولکولی پایین مانند سوبستراها یا بازدارندهها و یا دیگر پروتئینها رخ میدهند. یک پروتئین برهمکنش کننده، مکانهای اتصالی دارد که مکمل لیگاند هستند. این اتصال میتواند تلفیقی از برهمکنشهای آبگریز یا الکتروستاتیک و یا برهمکنشهای مولکولی کوتاه مانند نیروهای واندروالس و پیوندهای هیدروژنی باشد. یک لیگاند خاص بهصورت کووالانسی به یک ماتریس کروماتوگرافی خنثی متصل میشود (شکل 1). در شرایطی که اتصال ویژه و برگشتپذیر پروتئین با لیگاند حاصل شود، نمونه مورد آنالیز قرار میگیرد. از آنجایی که در طول عبور ماده مخلوط از ستون، تنها پروتئین موردنظر جذب سطحی میشود، لذا دیگر ترکیبات، شسته شده و بدون جذب از ستون عبور میکنند. برای شستشوی مولکول هدف، شرایط بهگونهای تنظیم میشود که برهمکنش پروتئین – لیگاند شکسته شود.
در ابتدا این روش در سال 1968 برای خالصسازی آنزیمها به کار گرفته شد و از آن زمان، کاربرد آن به پروتئینهای گیرنده، ایمونو گلوبولینها، نوکلئوتیدها و حتی به سلولهای کامل، گسترش یافته است. کاربرد این روش تنها با در دسترس بودن لیگاندهای اختصاصی برای پروتئین موردنظر، محدود میشود.
1-2- فاز ساکن
برای کروماتوگرافی میل ترکیبی، یک ماتریس ایدهآل باید ویژگیهای مشخصی داشته باشد. اول از همه ماتریس باید گروههای شیمیایی مناسبی داشته باشد که لیگاند بتواند بهصورت کووالانسی به آن متصل شود تا سطح بزرگی را برای اتصال فراهم آورد. شرایط سختی که در طول فرآیند مشتقسازی به وجود میآید، ایجاب میکند که ماتریس از لحاظ شیمیایی و مکانیکی پایدار باشد. همچنین ماتریس موردنظر باید نسبت به حلالها و بافرهای مورد استفاده در فرآیند، به ویژه در مرحله شویش پروتئین بیاثر باشد. بنابراین، ماتریسهای هیدروفیلی و خنثی بهمنظور جلوگیری از برهمکنش غیراختصاصی پروتئین با ماتریس ترجیح داده میشوند. ماتریس باید ماکرو پوروس باشد تا برهمکنش پروتئینهای بزرگ و لیگاندها را در خود جای دهد و در عین حال، جریان بتواند به خوبی از آن عبور کند. آگاروز متداولترین ماتریس کروماتوگرافی میل ترکیبی است؛ به دلیل این که راههای ساده و مناسبی برای اتصال لیگاندها به آگاروز وجود دارد. تعدادی ماتریسهای آلی و معدنی سنتزی نیز بهعنوان بستر کروماتوگرافی وجود دارند که از میان آنها میتوان به موارد زیر اشاره نمود؛ دکسترانهای اتصال عرضی شده، پلی استایرن، پلی آکریلامید، سلولز، سیلیکا و شیشه متخلخل.
2-2- لیگاندها
یک فرآیند تخلیص موفق به لیگاندی نیاز دارد که عملکردی اختصاصی داشته و به ماتریس کروماتوگرافی نیز به روش کووالانسی متصل شده باشد. لیگاندها باید بسیار انتخابی عمل نموده و تنها به یک یا تعداد کمی از پروتئینها اتصال یابند. از جمله مثالها در این مورد، میتوان آنتیبادیها، گیرندههای پروتئینی، هورمونهای استروییدی، ویتامینها و بازدارندههای آنزیمی را نام برد. برخی لیگاندها عملکرد اختصاصی ضعیفی داشته و به یک گروه از ترکیبات دارای ساختار مشابه با ویژگیهای شیمیایی مشابه متصل میشوند. با این وجود، این برهمکنشها برای حل برخی از مشکلات جداسازی کارگشا هستند. بهعنوان مثال در این زمینه، استافیلوکوکال، پروتئینهای (A) و (G) به عنوان لیگاند هستند که برای ایمونوگلوبولینها استفاده میشوند.
لیگاندهای کوپل شده باید قادر باشند، کمپلکسهای برگشتپذیری با پروتئینهایی که قرار است جدا شوند تشکیل دهند. پایداری کمپلکس تشکیل شده نیز باید در حدی باشد که در طول فرآیند کروماتوگرافی باعث بازداری کامل پروتئین موردنظر شود. بسیار مهم است که پس از شستشوی ترکیبات بازداری نشده، تفکیک این کمپلکس با یک تغییر ساده در محیط، بدون تأثیرگذاری برگشتناپذیر بر پروتئین جداسازی شده و یا لیگاند متصل به آن صورت پذیرد. برای تهیه جاذبهای میل ترکیبی، لیگاند باید با حلالهای مورد استفاده در فرآیند کروماتوگرافی سازگار باشد. به این منظور، بهترین نوع لیگاند برای کروماتوگرافی میل ترکیبی، یک مولکول سنتزی است که پایدار، ایمن و ارزان باشد. لیگاندهای پروتئینی معمولاً گزینشپذیری مناسبی فراهم میآورند ولی برای تولید مناسب نیستند؛ زیرا در طول فرآیند پاکسازی ستون تخریب میشوند؛ علاوهبر آن، پروتئینها گران هستند و باید قبل از اتصال به ستون، خلوص بالایی داشته باشند. ضروری است که لیگاند موردنظر حداقل یک گروه عاملی داشته باشد که با استفاده از آن روی بستر تثبیت شود. متداولترین این گروهها، آمینها، تیولها، کربوهیدروکسایدها و گروههای هیدروکسیل هستند.
لیگاندهای کوپل شده باید قادر باشند، کمپلکسهای برگشتپذیری با پروتئینهایی که قرار است جدا شوند تشکیل دهند. پایداری کمپلکس تشکیل شده نیز باید در حدی باشد که در طول فرآیند کروماتوگرافی باعث بازداری کامل پروتئین موردنظر شود. بسیار مهم است که پس از شستشوی ترکیبات بازداری نشده، تفکیک این کمپلکس با یک تغییر ساده در محیط، بدون تأثیرگذاری برگشتناپذیر بر پروتئین جداسازی شده و یا لیگاند متصل به آن صورت پذیرد. برای تهیه جاذبهای میل ترکیبی، لیگاند باید با حلالهای مورد استفاده در فرآیند کروماتوگرافی سازگار باشد. به این منظور، بهترین نوع لیگاند برای کروماتوگرافی میل ترکیبی، یک مولکول سنتزی است که پایدار، ایمن و ارزان باشد. لیگاندهای پروتئینی معمولاً گزینشپذیری مناسبی فراهم میآورند ولی برای تولید مناسب نیستند؛ زیرا در طول فرآیند پاکسازی ستون تخریب میشوند؛ علاوهبر آن، پروتئینها گران هستند و باید قبل از اتصال به ستون، خلوص بالایی داشته باشند. ضروری است که لیگاند موردنظر حداقل یک گروه عاملی داشته باشد که با استفاده از آن روی بستر تثبیت شود. متداولترین این گروهها، آمینها، تیولها، کربوهیدروکسایدها و گروههای هیدروکسیل هستند.
3-2- بازوی حایل
برای جلوگیری از تأثیر گذاشتن اتصال لیگاند به ماتریس، بر توانایی آن در اتصال به مولکول هدف، بهتر است یک بازوی حایل میان لیگاند و ماتریس قرار داد (شکل 1). در نتیجه لیگاند از سطح ماتریس فاصله گرفته و ممانعت فضایی را نسبت به حالتی که لیگاند بهصورت مستقیم به ماتریس متصل باشد، کاهش میدهد.
بازوهای حایل، برای لیگاندهای کوچک تثبیت شده بسیار اهمیت دارند، اما برای لیگاندهای بزرگتر وجودشان الزامی نیست. مناسبترین طول برای بازوی حایل، (10-6) اتم کربن یا معادل آن است. بازوهای حایل نباید از لحاظ شیمیایی و یا ساختاری، اثری روی نمونه یا لیگاند داشته باشند.
بازوهای حایل، برای لیگاندهای کوچک تثبیت شده بسیار اهمیت دارند، اما برای لیگاندهای بزرگتر وجودشان الزامی نیست. مناسبترین طول برای بازوی حایل، (10-6) اتم کربن یا معادل آن است. بازوهای حایل نباید از لحاظ شیمیایی و یا ساختاری، اثری روی نمونه یا لیگاند داشته باشند.
4-2- اتصال لیگاند
بهطور کلی، فرآیند تثبیت لیگاند شامل سه مرحله است. ابتدا ماتریس برای واکنش با گروه عاملی لیگاند فعال میشود. پس از آن لیگاند بهصورت کووالانسی، از طریق یک واکنش شیمیایی اتصال مییابد و در نهایت، گروههای باقیمانده واکنش نداده و با مقدار اضافی از ترکیبی با وزن مولکولی پایین مانند اتانول آمین، بلوکه میشوند. این عمل موجب میشود تا از همه اتصالات میان لیگاند و نمونه اطمینان حاصل نمود.
روشهای فعالسازی یک جاذب میل ترکیبی، براساس شیمی لیگاند و جاذب و این که آیا بازوی حایل مورد نیاز است یا خیر، متغیر است. برخی از روشهای متداول تثبیت در جدول (1) نشان داده شدهاند. ماتریس باید بهگونهای فعال شده باشد که با روش شیمی ملایم، اتصال کووالانسی لیگاند به آن انجام شود.
فعالسازی معمولا شامل وارد کردن یک گروه الکتروفیلی به ماتریس است. در طول اتصال لیگاند، این گروه با گروههای نوکلئوفیلی مانند آمین، تیول و گروه هیدروکسیل واکنش میدهد. ماتریسی که با گروههای نوکلئوفیلی مانند تیول فعال شده باشد را هم میتوان برای اتصال لیگاندی که حاوی گروههای الکتروفیلی است فعال نمود؛ گرچه چنین فرآیندی کمتر متداول است.
روشهای فعالسازی یک جاذب میل ترکیبی، براساس شیمی لیگاند و جاذب و این که آیا بازوی حایل مورد نیاز است یا خیر، متغیر است. برخی از روشهای متداول تثبیت در جدول (1) نشان داده شدهاند. ماتریس باید بهگونهای فعال شده باشد که با روش شیمی ملایم، اتصال کووالانسی لیگاند به آن انجام شود.
فعالسازی معمولا شامل وارد کردن یک گروه الکتروفیلی به ماتریس است. در طول اتصال لیگاند، این گروه با گروههای نوکلئوفیلی مانند آمین، تیول و گروه هیدروکسیل واکنش میدهد. ماتریسی که با گروههای نوکلئوفیلی مانند تیول فعال شده باشد را هم میتوان برای اتصال لیگاندی که حاوی گروههای الکتروفیلی است فعال نمود؛ گرچه چنین فرآیندی کمتر متداول است.
جدول 1: مروری بر برخی روشهای متداول تثبیت
5-2- فاز متحرک
در کروماتوگرافی میل ترکیبی باید حداکثر دقت را بهمنظور برقراری اتصال میان مولکول هدف و لیگاند به عمل آورد. شرایط بافر برای برقراری یک اتصال ایدهآل باید بهگونهای تغییر داده شود که از برهمکنش موثر مولکول هدف با لیگاند، اطمینان حاصل شود و مولکول هدف توسط محیط کروماتوگرافی میل ترکیبی، بازداری شده و برهمکنشهای غیرویژه به حداقل برسد. در اغلب موارد، بافر اتصال برای شستشوی ترکیبات اتصال نیافته از ستون بدون شستشوی مولکولهای هدف هم به کار میرود. تغییر سرعت جریان میتواند اثرات شگفتآوری بر موفقیت روش کروماتوگرافی میل ترکیبی داشته باشد. اگر نمونه با سرعت بالایی پمپ شود، اتصال به خوبی برقرار نمیشود. در فاز شستشو، شرایط بافر بهگونهای تغییر میکند که برهمکنش میان مولکول هدف و لیگاند را بشکند و در نتیجه مولکول هدف از ستون خارج شود.
6-2- راهبرد شویش
اساس واجذب، تغییر تعادل اتصال مواد جذب شده از فاز ساکن به فاز متحرک است و این امر به کمک تغییر شرایط محلولی رخ میدهد که پیوند لیگاند و بیومولکول در آن رخ داده است و تغییر شرایط بهگونهای است که دیگر در آن، این اتصال مطلوب نیست. این کار با راههای مختلفی قابل انجام است چه به روش ویژه و چه غیرویژه. این که بافر شویش سریع عمل کند و عملکرد یا فعالیت پروتئین موردنظر را تغییر ندهد بسیار مهم است.
برهمکنش لیگاند – پروتئین براساس تلفیقی از برهمکنشهای الکتروستاتیک و هیدروفوبیک و پیوندهای هیدروژنی است. عواملی که این برهمکنشها را ضعیف میسازند، ممکن است بهعنوان شویندههای موثر غیرویژه عمل کنند. درنظر داشتن اهمیت نسبی این سه نوع برهمکنش روی پایداری پروتئین متصل شده به انتخاب یک شوینده مناسب کمک میکند.
برهمکنش لیگاند – پروتئین براساس تلفیقی از برهمکنشهای الکتروستاتیک و هیدروفوبیک و پیوندهای هیدروژنی است. عواملی که این برهمکنشها را ضعیف میسازند، ممکن است بهعنوان شویندههای موثر غیرویژه عمل کنند. درنظر داشتن اهمیت نسبی این سه نوع برهمکنش روی پایداری پروتئین متصل شده به انتخاب یک شوینده مناسب کمک میکند.
یک تغییر (pH) منجر به تغییر حالت یونیزاسیون گروهها در لیگاند و مولکول هدف شده و اثر بسیار مهمی بر اتصال میگذارد. در نتیجه، متداولترین روش شستشوی موادی که به شدت اتصال یافتهاند، بهصورت غیراختصاصی، کاهش (pH) بافر است (شکل 2). برای واجذب، اغلب (pH) حدود (2) لازم است؛ اما میزان (pH) را پایداری شیمیایی ماتریس، لیگاند و مواد جذب شده و این که (pH) بافر را تا چه حد میتوان کاهش داد، تعیین میکند. اگر شویش با تغییر (pH) انجام شود گاهی لازم است که (pH) اجزای جمعآوری شده را بلافاصله پس از شستشو خنثی کند تا خطر از دست دادن ساختار پروتئین به حداقل برسد.
متداولترین روش برای اتصال، فعالسازی اولیه با سیانوژن برماید است که با گروههای هیدروکسیل ماتریس پلی ساکارید برهمکنش میدهد تا یک ماتریس فعال بهوجود آورد. ماتریسهای فعال شده با (CNBr) برای اتصال لیگاندهایی مانند پلی پپتیدها و پروتئینها بسیار مناسب هستند؛ زیرا در شرایط قلیایی ضعیف (10-9 pH) با آمینهای نوع اول واکنش داده و مشتقات ایزو اوره بهوجود میآورند. متأسفانه پیوند ایزو اوره در (pH) فیزیولوژیک (9/5 ~ pKa) بار مثبت دارد و خواص تبادل آنیونی به جاذب میبخشد. از طرف دیگر، بسیاری از لیگاندهایی که اتصال مییابند بار منفی دارند؛ بنابراین مشتقات ایزو اوره ممکن است اثرات احتمالی تبادل کاتیونی را خنثی کنند. با این همه، روش (CNBr) برای اتصال تک نقطهای لیگاند مناسب نیست؛ زیرا پیوند ایزو اوره به راحتی میشکند و از آنجا که (CNBr) به شدت سمی است و با اسیدی شدن محیط (HCN) آزاد میکند، ماتریسهای تجاری فعال در این مورد توصیه میشوند.
ماتریس را با دیگر واکنشهای شیمیایی نیز میتوان فعال کرد. به عنوان مثال، ماتریس پلی ساکارید را میتوان با اپی کلروهیدرین یا بیس اپوکسیرانها که گروه اپوکسی را بهعنوان الکتروفیل به ماتریس وارد میکنند، فعال نمود.
به غیر از واکنش با آمینهای نوع اول، گروه اپوکسی با سولفهیدریل به سرعت و به آهستگی با گروههای هیدروکسیل واکنش میدهد. این پدیده از آنجایی مفید است که امکان اتصال لیگاندهای قندی را فراهم میآورد. زمانی که از بیس اکسیران استفاده میشود، ویژگی قابل توجهی مشاهده میشود و آن، لیگاندی است که بهوجود میآید؛ زیرا بهگونهای است که خود بخود یک بازوی حایل هیدروفیلی (12) کربنه دارد که برای کاربردهای خاصی مطلوب است.
پس از اتصال یک آلکانوئیک اسید بهعنوان بازوی حایل، گروه کربوکسیل انتهایی این قطعه را میتوان باز هم با استفاده از استر N-هیدروکسی سوکسین ایمید (NHS) فعال کرد. ماتریسهای فعال شده با (NHS) امروزه بهطور متداول استفاده میشوند، چنین ماتریسهایی با گروههای حاوی آمین نوع اول واکنش داده و پیوند پایدار آمیدی تشکیل میدهند.
ماتریسهای پلی ساکاریدی را میتوان با عوامل کربونیله کننده کم ضررتری مانند N و′N کربونیل دی ایمیدازول (CDI) فعال کرد تا مشتقات ایمیدازول کربنات تولید شود. این مشتقات در pHهای قلیایی به آسانی با لیگاندهای حاوی آمینهای نوع اول، کربامات تشکیل میدهند. پیوند کربامات بسیار پایدار و در شرایط کروماتوگرافی تبادل یونی بدون بار است. البته این روش اتصال، حداقل فاصله از ماتریس را ایجاد میکند.
روشی که در آن هیچ بازوی حایلی به وجود نمیآید از سولفونیل هالیدهایی چون توسیل کلراید و یا فعالتر از آن از ترسیل کلراید استفاده میکند. این واکنشگرها با گروههای هیدروکسیل واکنش داده و سولفوناتها را بهوجود میآورند که گروههای ترک کننده بسیار خوبی بوده و امکان اتصال مستقیم نوکلئوفیلهای لیگاند به کربن هیدروکسیل را فراهم میآورند. افزایش قدرت یونی بافر هم برای شویش پروتئینهای اتصال یافته کارآمد است. از نمک (NaCl) یک مولار اغلب برای این هدف استفاده میشود. زمانی که اتصال از طریق برهمکنشهای قوی هیدروفوبیک انجام شود از روشهای سختتری برای شویش مانند کاهش قطبیت یا افزودن نمکهای کیلیتدهنده باید استفاده شود.
متداولترین روش برای اتصال، فعالسازی اولیه با سیانوژن برماید است که با گروههای هیدروکسیل ماتریس پلی ساکارید برهمکنش میدهد تا یک ماتریس فعال بهوجود آورد. ماتریسهای فعال شده با (CNBr) برای اتصال لیگاندهایی مانند پلی پپتیدها و پروتئینها بسیار مناسب هستند؛ زیرا در شرایط قلیایی ضعیف (10-9 pH) با آمینهای نوع اول واکنش داده و مشتقات ایزو اوره بهوجود میآورند. متأسفانه پیوند ایزو اوره در (pH) فیزیولوژیک (9/5 ~ pKa) بار مثبت دارد و خواص تبادل آنیونی به جاذب میبخشد. از طرف دیگر، بسیاری از لیگاندهایی که اتصال مییابند بار منفی دارند؛ بنابراین مشتقات ایزو اوره ممکن است اثرات احتمالی تبادل کاتیونی را خنثی کنند. با این همه، روش (CNBr) برای اتصال تک نقطهای لیگاند مناسب نیست؛ زیرا پیوند ایزو اوره به راحتی میشکند و از آنجا که (CNBr) به شدت سمی است و با اسیدی شدن محیط (HCN) آزاد میکند، ماتریسهای تجاری فعال در این مورد توصیه میشوند.
ماتریس را با دیگر واکنشهای شیمیایی نیز میتوان فعال کرد. به عنوان مثال، ماتریس پلی ساکارید را میتوان با اپی کلروهیدرین یا بیس اپوکسیرانها که گروه اپوکسی را بهعنوان الکتروفیل به ماتریس وارد میکنند، فعال نمود.
به غیر از واکنش با آمینهای نوع اول، گروه اپوکسی با سولفهیدریل به سرعت و به آهستگی با گروههای هیدروکسیل واکنش میدهد. این پدیده از آنجایی مفید است که امکان اتصال لیگاندهای قندی را فراهم میآورد. زمانی که از بیس اکسیران استفاده میشود، ویژگی قابل توجهی مشاهده میشود و آن، لیگاندی است که بهوجود میآید؛ زیرا بهگونهای است که خود بخود یک بازوی حایل هیدروفیلی (12) کربنه دارد که برای کاربردهای خاصی مطلوب است.
پس از اتصال یک آلکانوئیک اسید بهعنوان بازوی حایل، گروه کربوکسیل انتهایی این قطعه را میتوان باز هم با استفاده از استر N-هیدروکسی سوکسین ایمید (NHS) فعال کرد. ماتریسهای فعال شده با (NHS) امروزه بهطور متداول استفاده میشوند، چنین ماتریسهایی با گروههای حاوی آمین نوع اول واکنش داده و پیوند پایدار آمیدی تشکیل میدهند.
ماتریسهای پلی ساکاریدی را میتوان با عوامل کربونیله کننده کم ضررتری مانند N و′N کربونیل دی ایمیدازول (CDI) فعال کرد تا مشتقات ایمیدازول کربنات تولید شود. این مشتقات در pHهای قلیایی به آسانی با لیگاندهای حاوی آمینهای نوع اول، کربامات تشکیل میدهند. پیوند کربامات بسیار پایدار و در شرایط کروماتوگرافی تبادل یونی بدون بار است. البته این روش اتصال، حداقل فاصله از ماتریس را ایجاد میکند.
روشی که در آن هیچ بازوی حایلی به وجود نمیآید از سولفونیل هالیدهایی چون توسیل کلراید و یا فعالتر از آن از ترسیل کلراید استفاده میکند. این واکنشگرها با گروههای هیدروکسیل واکنش داده و سولفوناتها را بهوجود میآورند که گروههای ترک کننده بسیار خوبی بوده و امکان اتصال مستقیم نوکلئوفیلهای لیگاند به کربن هیدروکسیل را فراهم میآورند. افزایش قدرت یونی بافر هم برای شویش پروتئینهای اتصال یافته کارآمد است. از نمک (NaCl) یک مولار اغلب برای این هدف استفاده میشود. زمانی که اتصال از طریق برهمکنشهای قوی هیدروفوبیک انجام شود از روشهای سختتری برای شویش مانند کاهش قطبیت یا افزودن نمکهای کیلیتدهنده باید استفاده شود.
3- کروماتوگرافی اندازه طردی
در تمامی روشهایی که تاکنون مورد بحث قرار گرفتند، بازداری، براساس برهمکنش میان پروتئین و ماتریس بوده است. کروماتوگرافی اندازه طردی بهترین روش برای حفظ ساختار و عملکرد پروتئینها است. در کروماتوگرافی اندازه طردی، ماتریس شامل ذرات متخلخل است و جداسازی براساس اندازه و شکل مولکول انجام میشود(شکلهای (3) و (4)). نام دیگر این روش ژل فیلتراسیون و یا ژل تراوایی است.
1-3- غربال مولکولی
برای جداسازی در (SEC) از خواص غربالگری مولکولی برخی ماتریسهای متخلخل استفاده میشود. ماتریسهای (SEC) گستره وسیعی از ذرات هستند که تفاوت اندکی در اندازه حفره خود دارند. فرآیند جداسازی به توانایی متفاوت پروتئینهای مختلف برای ورود به تمامی، بخشی و یا هیچ کدام از کانالها در ذرات متخلخل بستگی دارد. مولکولهایی که از ستون (SEC) عبور میکنند باید از یک ماز عبور نمایند که هر چه مولکول کوچکتر باشد این ماز پیچیدهتر میشود؛ زیرا مولکولهای کوچک، کانالهای عبور بالقوه بیشتری در دسترس دارند. از طرف دیگر، مولکولهای بزرگتر به دلایل فضایی از کانالها طرد میشوند و به آسانی از میان ذرات عبور میکنند. در نتیجه، مولکولهای کوچکتر بیشتر بازداری شده و مولکولهای بزرگتر کمتر بازداری میشوند. بهطور کلی، جداسازی در (SEC) براساس وزن مولکولی است، این ادعا که جداسازی براساس طرد و یا جذب متفاوت درون حفرات است، دقیقتر است. سهولت نفوذ به حجم هیدرودینامیک بستگی دارد؛ تفاوت میان حجم هیدرودینامیک و وزن مولکولی، در شکل مولکول است. پروتئینها تمایل دارند تا به شکل کروی باشند در حالی که (DNA) و یا پلی ساکاریدها تمایل دارند به شکل خطی قرار گیرند. مولکولهای خطی حجم هیدرودینامیک بزرگتری از مولکولهای کروی دارند؛ بنابراین، یک مولکول (DNA) با وزن مولکولی 10/000 سریعتر از پروتئینی با وزن مولکولی10/000 از ستون خارج میشود.
2-3- فاز ساکن
چنین تلقی میشود که در (SEC)، گزینشگری تنها به تخلخل ذاتی مواد بستگی دارد. در نتیجه، شیمی فاز ساکن بهگونهای انتخاب میشود که خواص جذب سطحی آن در حداقل میزان خود باشد. ماتریسهای مورد استفاده در روش (SEC) متشکل از پلیمرهای طبیعی مانند آگاروز و یا دکستران هستند اما میتوانند مخلوطی از پلیمرهای سنتزی مانند پلی آکریلامید هم باشند.
ژلها را ممکن است که از طریق برقراری اتصالات عرضی به شکل شبکهای سه بعدی تهیه نمود. اندازه حفرات را میتوان با تغییر درجه اتصال عرضی بهدست آورد. اولین ماتریس (SEC) تجاری، سفادکس، از برقراری اتصال عرضی میان دکستران و اپی کلروهیدرین بهوجود آمده است. امروزه ژلهای بسیاری بهصورت تجاری با اندازه حفرات متنوع وجود دارند. سطح این بسترها عمدتاً حاوی گروههای هیدروکسیل است که محیط خوبی را برای پروتئینهای هیدروفیل فراهم میآورد. اگر چه این هیدروفیلیسیته تا حدی با ورود عوامل اتصال عرضی کننده کاهش مییابد. برخی پلیمرها مانند آگاروز قادر به تشکیل خود بخود ژل در شرایط آپروتیک هستند. سیلیکاهای ماکروپوروس هم در (SEC) استفاده شدهاند اما باید با یک لایه هیدروفیلی برای جلوگیری از تخریب پروتئین پوشانده شوند.
تمامی مولکولهای بزرگتر از اندازه حفره کاملاً از کانالهای حفرات طرد میشوند؛ بنابراین، بازداری نشده و به همراه هم از ستون خارج میشوند. در نتیجه، اندازه حفرات ژل را میتوان بهگونهای طراحی کرد که همه مولکولهایی که اندازه آنها بیشتر از اندازه حفرات است از ستون خارج شوند.
همچنین اندازه حفرات، سرعت مولکولهایی که وارد حفرات میشوند را هم تعیین میکنند. زمان میانگین اقامت مولکولها در کانالها، به اندازه و شکل مولکولهایی که وارد حفرات میشوند بستگی دارد؛ بنابراین، مولکولهای مختلف، زمان اقامت مختلفی در ستون دارند. رزینها معمولاً براساس ظرفیت جداسازی اندازههای مختلف یک پروتئین کروی فرضی، طبقهبندی میشوند. حد بالایی، حدی است که مولکولهای بزرگتر کاملاً از کانالها خارج میشوند و بنابراین، هیچ جداسازی رخ نمیدهد. حد پایینی حدی است که مولکولهای کوچکتر قادرند وارد کانالها شوند؛ بنابراین، مولکولهایی که از این حد کوچکتر هستند کانال دیگری برای دسترسی نداشته و به همین دلیل، هیچ گزینشگری میان این اندازهها رخ نمیدهد. محدوده خطی میان این دو حد آن چیزی است که برای هر ماتریس گزارش میشود.
ژلها را ممکن است که از طریق برقراری اتصالات عرضی به شکل شبکهای سه بعدی تهیه نمود. اندازه حفرات را میتوان با تغییر درجه اتصال عرضی بهدست آورد. اولین ماتریس (SEC) تجاری، سفادکس، از برقراری اتصال عرضی میان دکستران و اپی کلروهیدرین بهوجود آمده است. امروزه ژلهای بسیاری بهصورت تجاری با اندازه حفرات متنوع وجود دارند. سطح این بسترها عمدتاً حاوی گروههای هیدروکسیل است که محیط خوبی را برای پروتئینهای هیدروفیل فراهم میآورد. اگر چه این هیدروفیلیسیته تا حدی با ورود عوامل اتصال عرضی کننده کاهش مییابد. برخی پلیمرها مانند آگاروز قادر به تشکیل خود بخود ژل در شرایط آپروتیک هستند. سیلیکاهای ماکروپوروس هم در (SEC) استفاده شدهاند اما باید با یک لایه هیدروفیلی برای جلوگیری از تخریب پروتئین پوشانده شوند.
تمامی مولکولهای بزرگتر از اندازه حفره کاملاً از کانالهای حفرات طرد میشوند؛ بنابراین، بازداری نشده و به همراه هم از ستون خارج میشوند. در نتیجه، اندازه حفرات ژل را میتوان بهگونهای طراحی کرد که همه مولکولهایی که اندازه آنها بیشتر از اندازه حفرات است از ستون خارج شوند.
همچنین اندازه حفرات، سرعت مولکولهایی که وارد حفرات میشوند را هم تعیین میکنند. زمان میانگین اقامت مولکولها در کانالها، به اندازه و شکل مولکولهایی که وارد حفرات میشوند بستگی دارد؛ بنابراین، مولکولهای مختلف، زمان اقامت مختلفی در ستون دارند. رزینها معمولاً براساس ظرفیت جداسازی اندازههای مختلف یک پروتئین کروی فرضی، طبقهبندی میشوند. حد بالایی، حدی است که مولکولهای بزرگتر کاملاً از کانالها خارج میشوند و بنابراین، هیچ جداسازی رخ نمیدهد. حد پایینی حدی است که مولکولهای کوچکتر قادرند وارد کانالها شوند؛ بنابراین، مولکولهایی که از این حد کوچکتر هستند کانال دیگری برای دسترسی نداشته و به همین دلیل، هیچ گزینشگری میان این اندازهها رخ نمیدهد. محدوده خطی میان این دو حد آن چیزی است که برای هر ماتریس گزارش میشود.
3-3- فاز متحرک
برخلاف دیگر ماتریسها، گزینشگری ماتریس (SEC) با تغییر ترکیب فاز متحرک قابل تغییر نیست. در بهترین حالت هیچ جذب سطحی رخ نمیدهد و فاز متحرک را باید تنها بهعنوان فاز حامل در نظر گرفت و نه یک عامل تأثیرگذار بر کروماتوگرافی. اگر چه نمونه ممکن است به یک محلول بافر با (pH) و قدرت یونی معین برای حفظ ساختار و فعالیت بیولوژیکی ماده موردنظر نیاز داشته باشد.
1-3-3- راهبرد شویش
از آنجایی که مولکولها در ستون (SEC) جذب سطحی نشده و فقط بازداری میشوند، پروتئینها به روش ایزو کراتیک شسته شده و به ترتیب بزرگی (بزرگترین مولکول در ابتدا) از ستون خارج میشوند. در این سیستم یک تک بافر استفاده میشود که به معنای آن است که نیازی به استفاده از پمپ گرادیان نیست. روش جداسازی (SEC) حداقل جداسازی با کمترین ظرفیت و بالاترین میزان دقت نمونه را در میان دیگر روشهای کروماتوگرافی بهدست میدهد. همچنین بهدلیل سهولت اجرای آن و برخی مشخصاتی که در دیگر روشها دیده نمیشود این روش، متداولترین روش است. مزیت اساسی (SEC)، عدم برهمکنش با نمونه است که باعث بالاترین درجه حفظ خواص بیولوژیکی آن میشود. علاوهبر این، از آنجایی که جداسازی به خواص جذب سطحی مولکول بستگی ندارد، (SEC) روشی برای جداسازی مالتیمرهایی که با استفاده از دیگر روشهای کروماتوگرافی قابل جداسازی نیستند، فراهم میآورد.
زمانی که نمونه وارد ستون میشود، جداسازی بهصورت مستقیم آغاز شده و به همین دلیل، مقطع عرضی باید به حد کافی برای حجم نمونه موردنظر بزرگ باشد. اگر چه طول ستون هم عامل مهمی است؛ زیرا بر درجه تفکیک و زمان فرآیند تأثیرگذار است. در نتیجه (SEC)، بهعنوان مرحله نهایی که حجم نمونه کاهش یافته است مورد استفاده قرار میگیرد.
زمانی که نمونه وارد ستون میشود، جداسازی بهصورت مستقیم آغاز شده و به همین دلیل، مقطع عرضی باید به حد کافی برای حجم نمونه موردنظر بزرگ باشد. اگر چه طول ستون هم عامل مهمی است؛ زیرا بر درجه تفکیک و زمان فرآیند تأثیرگذار است. در نتیجه (SEC)، بهعنوان مرحله نهایی که حجم نمونه کاهش یافته است مورد استفاده قرار میگیرد.
4-3- کاربردها
کروماتوگرافی اندازه طردی کاربرد وسیعی در تخلیص پروتئین چه به روش تجزیهای و چه تهیهای دارد. (SEC) تهیهای را میتوان به دو دسته تعویض بافر و جزء به جزءسازی تقسیمبندی نمود. تخلخل ماتریس براساس هدف موردنظر انتخاب میشود.
1-4-3- تعویض بافر
تعویض بافر حالتی است که ترکیبات با وزن مولکولی پایین در نمونه، بهعنوان مثال، مولکولهای نمک با ماده بافری دیگری در حلال تبادل میشوند. (SEC) را میتوان با استفاده از تعویض بافر به کار برد؛ زیرا مولکولهای نمک با وزن مولکولی پایین به آسانی از پروتئینهای بزرگ جدا میشوند. در این حالت، درجه تخلخل ژل به روشی که پروتئینها را دفع کند، انتخاب میشود. از آنجایی که پروتئینها در حجم خالی ستون وجود دارند در حالی که آلودگیها یا حل شوندههای با وزن مولکولی پایین در کانالهای حفرهها گیر افتادهاند، این فرآیند را در سرعت جریانهای بالا بدون از دست دادن قدرت تفکیک میتوان اجرا کرد. علاوهبر این، به دلیل این که حجم کل حفرات برای آلودگیهای با وزن مولکولی پایین حجم بالای نمونه در دسترس است، حتی حجمهای بالای نمونه را هم میتوان در یک مرحله خالصسازی کرد. این روش سریعتر و کارآمدتر از دیالیز است و حتی در مقیاسهای پایین (در حد نوک سمپلر) و یا مقیاسهای بالا (در حد لیتر) قابل انجام است.
2-4-3- جزء به جزءسازی پروتئین
در جزء به جزءسازی تهیهای، پروتئین موردنظر باید از بقیه حل شوندهها با اندازه مشابه جدا شود. از نقطه نظر تئوری، جداسازی کامل مولکولهای کروی که کمتر از 30درصد در جرم مولکولی متفاوت باشند، امکانپذیر نیست.
3-4-3- تعیین اندازه مولکولی
حجم شویش پروتئینها عمدتا با استفاده از اندازه مولکولی آنها تعیین میشود؛ در نتیجه، تهیه یک منحنی کالیبراسیون با پروتئینهایی با شکل مشابه و وزن مولکولی مشخص این امکان را فراهم میآورد که سایز مولکولی دیگر پروتئینها را تخمین زد. با این روش، (SEC) امکان تشخیص تفاوت در اندازه پروتئینهای سالم و تخریب شده را هم میدهد.
نتیجهگیری
در این مقاله به بحث در مورد دو نوع از متداولترین روشها برای تخلیص پروتئینها، کروماتوگرافی میل ترکیبی و کروماتوگرافی اندازه طردی پرداخته شد. در مورد هر روش به ویژگیهای کلی، خواص فاز ساکن به فاز متحرک و کاربردهای آن اشاره شد.کروماتوگرافی میل ترکیبی از جمله ویژهترین انواع کروماتوگرافی است؛ اما فاز ساکن آن بسیار گران است و اتصال برای یک مولکول خاص و یا یک دسته مولکول خاص برقرار میشود. در کروماتوگرافی میل ترکیبی، اغلب از ستونهای کوچک و سیستمهای ساده استفاده میشود. اصول جداسازی کروماتوگرافی اندازه طردی، نفوذ مولکولها به درون حفرات دانهها است. مولکولهای بزرگ قادر به نفوذ در حفرهها نیستند در صورتی که مولکولهای کوچکتر به درون حفرات نفوذ میکنند. از آنجا که حفرات، اندازههای مختلف دارند، مولکولها براساس جرم مولکولیشان از هم جدا میشوند.
منابـــع و مراجــــع
۱ – Roe, S., Protein Purification Techniques, Oxford University Press, Oxford (2001).
۲ – Scopes, R., Protein Purification, PrinciplePractice, Springer-Verlag, New York (1994).
۳ – Simpson, R. J., ProteinsProteomics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2003).
۴ – Sofer, G., Preparative chromatographic separations in pharmaceutical, diagnostic,Biotechnology industries: currentfuture trends, J Chromatogr A, 707, 23 (1995).
۵ – Sofer, G., Hagel, L., Handbook of Process Chromatography: A Guide to ptimization, Scale-upValidation, Academic Press, San Diego (1997).
۶ – Stulik, K., Pacakova, V.,Ticha, M., Some potentialitiesdrawbacks of contemporary size-exclusion chromatography, J Biochem Biophys Methods, 56, 1 (2003).
۷ – Wilson, K., Walker, J, PrinciplesTechniques of Practical Biochemistry, Cambridge University Press
۸ – Porath, J., gel filtration to adsorptive size exclusion, J Protein Chem, 16, 463 (1997).