روش‌های کروماتوگرافی برای تخلیص پروتئین‌ها -بخش اول

به‌منظور دستیابی به خلوص بالایی از پروتئین، چه برای مقاصد تجزیه‌ای و چه درمانی، استفاده از چندین مرحله کروماتوگرافی نیاز است. چندین روش کروماتوگرافی برای نیل به این هدف وجود دارد که از میان آن‌ها می‌توان، روش‌های تبادل یونی در pHهای مختلف، کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبی، کروماتوگرافی اندازه طردی و کروماتوگرافی میل ترکیبی را نام برد. جداسازی با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا در رو‌ش‌های فاز معکوس، تبادل یونی و اندازه طردی انجام می‌شود. کروماتوگرافی فاز معکوس، پروتئین‌ها را براساس هیدروفوبیسیته نسبی آنها جداسازی می‌کند، اما به دلیل استفاده از حلال‌های آلی و احتمال از بین رفتن برخی ترکیبات، این روش به‌طور عام برای همه پروتئین‌ها قابل انجام نیست. در کروماتوگرافی تبادل یونی، جداسازی براساس بار پروتئین‌ها صورت می‌گیرد ولی در کروماتوگرافی اندازه طردی، براساس سایز خلل و فرج فاز ساکن، پروتئین‌های بزرگ‌تر از پروتئین‌های کوچک‌تر جدا می‌شوند. کروماتوگرافی میل ترکیبی، مکمل فرآیندهای تخلیص پروتئین است و در آن مواد پرکننده ستون کروماتوگرافی حاوی لیگاندی است که آن لیگاند، به‌صورت ویژه به پروتئین هدف، متصل می‌شود.

این مقاله شامل سرفصل‌های زیر است:
1- مقدمه
2- کروماتوگرافی تبادل یونی
1-2- بار پروتئین‌ها
2-2- فاز ساکن
3-2- فاز متحرک
4-2- راهبرد شویش
3- روش‌های کروماتوگرافی بر پایه هیدروفوبیسیته
1-3- هیدروفوبیسیته
2-3- کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبیک
3-3- فاز ساکن
4-3- فاز متحرک
5-3- راهبرد شویش
نتیجه‌گیری

در آغاز دوران شیمی پروتئین، تنها روش جداسازی پروتئین‌ها، استفاده از تفاوت حلالیت نسبی آن‌ها با هم بود. بخشی از مخلوط، از طریق تغییر خواص حلال با افزودن نمک‌ها، حلال‌های آلی، پلیمرها، تغییر pH یا تغییر دما، رسوب‌دهی می‌شد. رسوب‌دهی جزء به جزء، امروزه برای جداسازی پروتئین‌های غشایی و نوکلئیک اسیدها به کار می‌رود. از اصول جذب سطحی در کروماتوگرافی ستونی استفاده وسیعی می‌شود. در شرایط خاصی، پروتئین‌ها می‌توانند روی فازهای جامد، به روش اختصاصی جذب شوند. ژل‌های کلسیم فسفات غالباً در گذشته برای جذب پروتئین‌ها به‌صورت اختصاصی از مخلوط‌های هتروژن حاوی چندین پروتئین استفاده شده‌اند. به علت قدرت جداسازی بالا در روش‌های کروماتوگرافی، روش‌های مختلفی برای جداسازی پروتئین‌ها با استفاده از آن ابداع شده‌است.
از ویژگی‌های عمومی پروتئین‌ها، می‌توان برای جداسازی آنها از همدیگر و همچنین جداسازی ناخالصی‌های غیرپروتئینی استفاده نمود. تفاوت‌های کوچک میان پروتئین‌ها، مانند اندازه، بار، هیدروفوبیسیته و برهم‌کنش‌های زیست ویژه از جمله این ویژگی‌ها هستند (شکل 1).

در یک فرآیند معمول کروماتوگرافی، اولین مرحله، مرحله به دام اندازی است که ماده مورد نظر به سطح جاذب متصل می‌شود در حالی که ناخالصی‌ها اتصال نمی‌یابند. پس از آن، پروتئین‌هایی که به میزان ضعیفی اتصال یافته‌اند قبل از تغییر شرایط به‌منظور شویش پروتئین مورد نظر، خارج می‌شوند [6-1].
انواع روش‌های کروماتوگرافی مایع (که عمدتاً در نوع فاز ساکن متفاوت هستند) برای خالص‌سازی پروتئین استفاده می‌شوند. تنها، فرآیند کروماتوگرافی اندازه طردی تا حدی متفاوت است؛ زیرا جداسازی در آن براساس تفاوت اندازه پروتئین‌ها و اندازه حفره‌های فاز ساکن است و نه براساس جذب سطحی. مقایسه دو روش کروماتوگرافی تبادل یونی و اندازه طردی در شکل (2) نشان داده شده‌است.

به‌طور کلی، روش‌های تخلیص پروتئین‌ها با استفاده از کروماتوگرافی را می‌توان به چهار دسته عمده کروماتوگرافی تبادل یونی، کروماتوگرافی بر پایه هیدروفوبیسیته، کروماتوگرافی میل ترکیبی و کروماتوگرافی اندازه طردی تقسیم‌بندی نمود. در مقاله حاضر، به دو روش نخست پرداخته خواهد شد و دو روش دیگر در قسمت دوم مقاله مورد بحث قرار خواهند گرفت.

پروتئین‌ها، ترکیبات آمفولیتی دارای بار مثبت و منفی هستند. نقطه ایزو الکتریک یک پروتئین (pI) (pH که در آن، بار کل پروتئین صفر است) به میزان دنباله‌های آمینو اسیدی قابل یونیزه شدن در ساختار آن بستگی دارد. بارهای مثبت، عمدتاً به‌وسیله آمینو اسیدهای آرژینین، لیزین و هیستدین بسته به pH بافر، ایجاد می‌شوند. هر آمین N-ترمینالی هم در pH پایین‌تر از (8) دارای بار مثبت است. بارهای منفی نیز عمدتاً در نتیجه آمینو اسیدهای آسپارتات و گلوتامات و گروه‌های کربوکسیل C-ترمینال ایجاد می‌شوند. تقریباً همگی این دنباله‌های آمینو اسیدی در pH بالاتر از (6) یونیزه می‌شوند. گروه‌های باردار، تقریباً همگی روی سطح پروتئین قرار دارند. تلفیقی از اثرات همه زنجیره‌های جانبی باردار به پروتئین، بار خالصی می‌بخشد که به pH نیز بستگی دارد [7].
با توجه به موارد گفته شده، پروتئین‌ها را می‌توان با استفاده از بارهای مثبت آنها روی فاز ساکن آنیونی و یا با استفاده از بارهای منفی آنها روی فاز ساکن کاتیونی جداسازی نمود. به‌طور کلی، کروماتوگرافی تبادل آنیونی در مقادیر pH بالاتر از نقطه ایزو الکتریک پروتئین مورد نظر انجام می‌شود در حالی که کروماتوگرافی تبادل کاتیونی در پایین‌تر از نقطه ایزو الکتریک پروتئین انجام می‌شود. محدوده pH که در آن کروماتوگرافی انجام می‌شود با توجه به محدوده pH که پروتئین در آن پایدار است، محدود می‌شود. برای دستیابی به نتایج مناسب، pH بافر مورد نظر باید حداقل یک واحد بیشتر یا پایین‌تر از نقطه ایزو الکتریک آنالیتی که جداسازی می‌شود، باشد [8].

تبادلگرهای یونی قوی، گروه‌های عاملی چون سولفونات و آمونیوم نوع چهارم دارند که pKa آنها خارج از محدوده‌ای است که برای اغلب پروتئین‌ها استفاده می‌شود (یعنی pH 10-4). بنابراین، تغییرات pH اثری بر بار تبادلگر یونی ندارد. اما تبادلگرهای یونی ضعیف، گروه‌های عاملی چون کربوکسیلات و دی اتیل آمونیوم با گستره pH قابلیت استفاده محدود دارند. بنابراین، پروتئین‌هایی که خصلت یونیزه شدن ضعیفی دارند و برای یونیزه شدن به pH خیلی بالا یا خیلی پایینی نیاز دارند را تنها با تبادلگرهای یونی قوی می‌توان جداسازی نمود. از طرف دیگر، برای پروتئین‌هایی که بار بالایی دارند، تبادلگرهای یونی ضعیف به چند دلیل مناسب هستند که از جمله آن‌ها می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

هدایت و pH بافر، اهمیت بسیار زیادی دارند زیرا میزان جذب سطحی با این عوامل تعیین می‌شود. برای جداسازی، باید هدایت پایین و pH که به پروتئین بار مناسبی ببخشد، انتخاب شود. نوع یون‌های بافر هم بر جداسازی اثر می‌گذارند. برای مثال، جاذبه الکتروستاتیک میان دو بار مخالف در یک محیط هیدروفوبیک بیشتر است. در بسیاری از موارد، بافر آمونیوم استات میزان جداسازی را افزایش می‌دهد. این بافر همچنین فرار است و به آسانی با لیوفیلیزه شدن از محیط حذف می‌شود.

از دو روش کلی برای این منظور استفاده می‌شود: تغییر pH بافر شستشو دهنده و یا افزایش قدرت یونی محیط با افزودن NaCl. اگر روش اول، تغییر pH استفاده شود، یک ستون تبادل آنیونی باید با کاهش pH شسته شود تا بار منفی پروتئین‌هایی که به ستون متصل شده‌اند را کم‌تر کند؛ در حالی که ستون تبادل کاتیونی باید با افزایش pH شسته شود تا بار مثبت پروتئین‌هایی که به ستون متصل شده‌اند را کاهش دهد. گر چه در عمل، روش تغییر pH چندان موفق نیست؛ زیرا بسیاری از پروتئین‌ها در محدوده نزدیک به نقطه ایزو الکتریک خود حلالیت اندکی نشان می‌دهند و باید مراقب رسوب‌دهی آن‌ها در ستون بود.
راهبرد متداول‌تر، افزایش غلظت یک نمک غیربافری مانند NaCl است. این یون‌ها با پروتئین، برای اتصال به رزین رقابت می‌کنند، پروتئین‌هایی که بار کم‌تری دارند در غلظت‌های پایین‌تر نمک، از ستون خارج می‌شوند در حالی که پروتئین‌هایی که بار بیشتری دارند در غلظت‌های بالاتر نمک، از ستون خارج می‌شوند.
در شستشوی گرادیانی (شکل 4) غلظت بافر به‌طور متناوب تغییر داده می‌شود. در ابتدا پروتئینی که ضعیف‌تر متصل شده بود از ستون خارج شده و در غلظت‌های کمی بالاتر بافر پروتئین دوم خارج می‌شود و به همین ترتیب جداسازی انجام می‌شود. شستشوی گرادیانی منجر به جداسازی بهتری می‌شود، زیرا در این روش به دلیل افزایش تدریجی قدرت شویندگی، پیک‌ها خیلی پهن نمی‌شوند. کاهش شیب گرادیانی منجر به جداسازی بهتر می‌شود؛ اگر شیب، بیشتر کاهش یابد، پروتئین‌ها هم رقیق‌تر می‌شوند. اما به دلیل نیاز به تجهیزات بیشتر، شستشوی گرادیانی در فرآیندهای صنعتی مناسب نیست. بهترین شرایطی که در شستشوی گرادیانی می‌توان به آن دست یافت، این است که در مرحله اول، ناخالصی‌ها را خارج ساخته و پس از آن، پروتئین مورد نظر و در نهایت تمامی نمونه‌هایی که محکم به ستون متصل شده‌اند را از ستون خارج ساخت.

واژه هیدروفوب به معنای آب گریز است و به خاصیت فیزیکی مولکولی که آب را دفع می‌کند، بر می‌گردد. در حال حاضر، هیچ روش اندازه‌گیری منحصر به فرد مورد پذیرشی برای هیدروفوبیسیته پروتئین‌ها وجود ندارد. مقیاس‌های متفاوت هیدروفوبیسیته براساس انرژی آزاد انتقال آمینو اسیدها از حلال آلی به آب به وجود آمده است. به‌طور کلی، آمینو اسیدهای هیدروفوبیک آن‌هایی هستند که زنجیره جانبی آن‌ها فاقد گروه‌های عاملی است که قادر به تشکیل پیوندهای هیدروژنی باشند (به‌عنوان مثال، ایزولوسین، والین، لوسین و فنیل آلانین) بنابراین، تمایلی به حضور در آب ندارند. به همین دلیل، اغلب این آمینو اسیدها درون حفره هیدروفوبی پروتئین‌ها و یا درون بخش لیپیدی غشا وجود دارند. از آنجایی که تنها بخش کوچکی از آمینو اسیدها درون حفره‌ها پوشانده می‌شوند، برخی از آمینو اسیدهای هیدروفوب همچنان روی سطح باقی می‌مانند. بنابراین، هیدروفوبیسیته کل پروتئین، مجموع هیدروفوبیسیته زنجیره‌های جانبی و اسکلت اصلی پروتئین است.
در یک محلول آبی، مناطق هیدروفوب روی پروتئین با یک فیلم منظم از مولکول‌های آب پوشانده می‌شوند (شکل 5-الف). این درجه نظم بالای مولکول‌های آب، منجر به کاهش انتروپی (S<0Δ) می‌شود. در نتیجه، ترکیبات هیدروفوب به‌صورت خود به خود، به‌منظور به حداقل رساندن مناطق هیدروفوب در معرض حلال، مجتمع می‌شوند (شکل 5-ب).

این پدیده از لحاظ انرژی هم بسیار مساعد است زیرا مولکول‌های آب که به شیوه‌ای منظم اطراف گروه‌های هیدروفوب قرار گرفته بودند به توده حلال که حاوی مولکول‌های آب است بر می‌گردند. این امر منجر به افزایش انتروپی سیستم شده که به نوبه خود باعث کاهش انرژی آزاد سیستم (G=ΔH-TΔSΔ) می‌شود. بنابراین، جذب سطحی پروتئین‌ها یک فرآیند مساعد ترمودینامیکی است که نیروی محرکه آن انتروپی و کاهش مساحت سطح است.

کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبیک (HIC)، براساس برهم‌کنش برگشت‌پذیر میان سطح پروتئین و یک فاز ساکن کروماتوگرافی با ماهیت هیدروفوبی است. پروتئین‌ها براساس تفاوت در میزان آمینو اسیدهای هیدروفوب در دسترسشان جداسازی می‌شوند. برای تسهیل برهم‌کنش‌های هیدروفوب، مخلوط پروتئین در حضور بافری با غلظت بالای نمک روی سطوح بارگذاری می‌شود.
مفهوم جداسازی پروتئین‌ها براساس HIC در سال 1948 توسط تیسلیوس پایه‌گذاری شد، و این در زمانی بود که وی برای اولین بار گزارش نمود که پروتئین‌ها در بافری که حاوی نمک است بازداری می‌شوند و این پدیده‌ای است که Salting out chromatography نامیده می‌شود. وی گزارش نمود که پروتئین‌ها و دیگر موادی که در غلظت‌های بالای نمک‌های خنثی، رسوب داده می‌شوند (Salting out) اغلب در غلظت‌های پایین‌تر از حدی که برای رسوب‌دهی آن‌ها مورد نیاز است با شدت بالایی جذب سطحی می‌شوند و جاذب‌هایی که در محلول‌های عاری از نمک کشش هیچ و یا بسیار اندکی به پروتئین‌ها نشان می‌دهند در غلظت‌های نسبتاً بالاتر، جاذب‌های بسیار ایده‌آلی هستند که از آن زمان تاکنون پیشرفت‌های زیادی در توسعه این روش حاصل شده‌است. اولین ماتریس مورد استفاده، ماتریسی با خواص هیدروفوبیک – یونی بود. پس از آن جاذب‌های هیدروفوب بدون بار سنتز شده و در نتیجه آن خصلت هیدروفوبی پدیده جذب سطحی ثابت گردید. این پیشینه موجب پیشنهاد نامی در سال 1973شد، نامی که اکنون پذیرفته شده‌است: کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبیک. همچنین اثبات گردید که اتصال پروتئین‌ها با افزایش غلظت نمک‌های خنثی افزایش می‌یابد و شویش پروتئین‌های اتصال یافته به بستر، به آسانی از طریق شستشوی ستون با بافرهای عاری از نمک و یا کاهش قطبیت شوینده انجام می‌شود [13-9].

بسیاری از انواع ماتریس‌ها برای استفاده به‌عنوان جاذب در HIC مناسب هستند اما عمده‌ترین جاذب مورد استفاده آگاروز بوده است. زمانی که این روش در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا هم استفاده شد، سیلیکا و رزین پلیمرهای آلی هم مورد استفاده قرار گرفتند. از آنجا که شویش، در قدرت یونی پایین انجام می‌شود، جاذب حتی‌الامکان باید بدون بار باشد تا برهم‌کنش یونی میان پروتئین و ماتریس رخ ندهد. لیگاندهایی که بیشترین استفاده را در HIC داشته‌اند آلکان‌های با زنجیر خطی یا بدون گروه آمین انتهایی بوده‌اند. به‌طور کلی، لیگاندهای آلکیل (به‌عنوان مثال، بوتیل یا اکتیل) خصلت هیدروفوبی مطلق دارند. گاهی اوقات بهتر است که از لیگاندهای آریل (به‌عنوان مثال، فنیل) استفاده نمود که برهم‌کنش‌های آروماتیک (π-π) را هم فراهم می‌آورند. یک گروه فنیل، همان هیدروفوبیسیته گروه پنتیل را دارد در حالی که گزینش‌گری کاملاً متفاوتی با یک لیگاند پنتیل دارد؛ زیرا گروه‌های آروماتیک روی پروتئین، تنها به‌طور ویژه با لیگاندهای آروماتیک برهم‌کنش می‌کنند. قدرت برهم‌کنش میان یک پروتئین و لیگاند هیدروفوب با افزایش طول زنجیر افزایش می‌یابد. لیگاندهای دارای 4 تا 10 اتم کربن برای اغلب مقاصد جداسازی مناسب هستند. اگر چه برای پروتئین‌هایی با حلالیت پایین در بافرهای با غلظت بالای نمک (مانند پروتئین‌های غشایی)، جاذب‌های HIC با لیگاندهای با طول زنجیر بلندتر مناسب‌تر هستند.

در روش HIC، نیاز به حضور یون‌های نمک ویژه‌ای است که به‌طور ترجیحی، مولکول‌های آب را جابجا نموده و برهم‌کنش هیدروفوبیک را تقویت می‌کند. هر دوی آنیون‌ها و کاتیون‌ها را می‌توان در یک لیست، که سری هوفمیستر (لیوتروپیک) نام دارد طبقه‌بندی نمود. یون‌هایی که برهم‌کنش مساعدتری دارند در ابتدای سری هستند و سری، براساس کاهش نیروی هیدروفوبی مرتب شده‌است.

PO₄^3-> SO₄^2-> CH₃COO^–> Cl^–> Br^–> NO₃^–> ClO₄^–> I^–> SCN^–: سری آنیونی
NH₄⁺> Rb⁺> K⁺> Na⁺> Li⁺> Mg²⁺> Ca²⁺> Ba²⁺: سری کاتیونی

آمونیوم سولفات ((NH₄)₂ SO₄) و سدیم سولفات (Na₂SO₄) متداول‌ترین نمک‌های مورد استفاده هستند. این نمک‌ها اثر پایدار کننده بر ساختار پروتئین دارند. آمونیوم سولفات در شرایط بازی، گاز آمونیاک را تشکیل می‌دهد؛ بنابراین، باید در pHهای پایین‌تر از (8) از آن استفاده نمود. سدیم سولفات به‌عنوان یک عامل Salting-out مناسب است اما اغلب باعث مشکلات حلالیت در غلظت‌های بالا می‌شود. از آنجا که HIC در قدرت یونی‌های بالا انجام می‌شود، باید خطر رسوب‌دهی پروتئین در سیستم یا ستون را مورد نظر قرار داد. غلظت نمک مورد استفاده باید کم‌تر از حد غلظت رسو‌ب‌دهی پروتئین در نمونه باشد. اغلب، آمونیوم سولفات 1M نقطه خوبی برای شروع است. اگر نمونه مورد نظر متصل نشود، لازم است محیط هیدروفوبیک‌تری استفاده شود. همچنین باید این نکته را در نظر داشت که پروتئین متصل شده در بافر، عاری از نمک با درجه بازیابی بالایی از ستون جدا می‌شود. pH بافر در HIC تأثیر بسیار مهمی در جذب سطحی پروتئین روی بستر دارد. اغلب، افزایش pH تا (10-9)، برهم‌کنش هیدروفوبیک میان پروتئین و لیگاند هیدروفوب را به علت تغییر در بار پروتئین، کاهش می‌دهد. با این وجود، برخی پروتئین‌های با pI بالا در pHهای بالا اتصال محکمی با ماتریس HIC برقرار می‌کنند. به همین دلیل، آزمایش pHهای مختلف برای پیدا کردن بهترین شرایط توصیه می‌شود. تنها محدودیت پایداری پروتئین مورد نظر برای خالص‌سازی و ماتریس کروماتوگرافی است (سیلیکا در pHهای بالا پایدار نیست).

درصورت کاهش غلظت نمک، برهم‌کنش هیدروفوبی ضعیف شده و بنابراین، پروتئین از ستون خارج می‌شود. عمل واجذب سطحی به ترتیب افزایش هیدروفوبیسیته سطح رخ می‌دهد. بسیاری از پروتئین‌ها تنها زمانی که غلظت نمک بسیار پایین باشد، شسته می‌شوند. برخی مواقع نیز لازم است که قطبیت حلال را کاهش داد. افزودن ترکیبات کاهنده قطبیت مانند اتیلن گلایکول نیز می‌تواند پس از حذف نمک از ستون و یا هم‌زمان با کاهش غلظت نمک انجام شود. گاهی برای خالص‌سازی پروتئین‌های غشایی، افزودن دترجنت (معمولاً 1 درصد) به‌عنوان جایگزینی برای پروتئین لازم است. در برخی موارد نیز اتصال به حدی قوی است که فر‌آیند کروماتوگرافی برای آن عملی نیست و عملاً اتصال، برگشت‌ناپذیر است. اگر برای شکست اتصال چنین پروتئین‌هایی نیاز به افزودن حلال‌های آلی، دترجنت و یا عوامل کیلیت‌ساز باشد، امکان تخریب ساختار پروتئین نیز وجود دارد. شستشوی گرادیانی خطی ساده، اولین انتخاب در آزمایش‌های اولیه است اما برای جداسازی بهتر در مناطقی که جداسازی به خوبی انجام نمی‌شود باید این گرادیان آهسته‌تر تغییر کند. در کاربردهای صنعتی تخلیص پروتئین، شستشوی مرحله‌ای مناسب‌تر از گرادیان است زیرا ساده‌تر و تکرار پذیرتر است.

کروماتوگرافی تبادل یونی یکی از قوی‌ترین روش‌های خالص‌سازی پروتئین، در حال حاضر است و احتمالاً متداول‌ترین روش برای جداسازی پروتئین‌ها، پلی پپتیدها، نوکلئیک اسیدها، پلی نوکلئوتیدها و دیگر بیومولکول‌های باردار است. از جمله مزایای این روش آن است که شویش، معمولاً در شرایط ملایم انجام می‌شود و به همین دلیل پروتئین کنفورماسیون اصلی خود را در طی فرآیند کروماتوگرافی حفظ می‌کند. به‌طور کلی، تبادلگرهای یونی بیشتر از بقیه جاذب‌های مورد استفاده در تخلیص پروتئین استخلاف‌دار شده‌اند و ظرفیت اتصال پروتئین آن‌ها بسیار بالاست. گزینش‌پذیری گسترده آن‌ها باعث حذف ناخالصی‌های مهم مانند اندوتوکسین‌ها می‌شود. از دیگر دلایل موفقیت تبادل یونی، اصول جداسازی آسان و سهولت کنترل روش است. علاوه‌بر آن، رزین‌های تبادل یونی بسیار پایدار بوده، به راحتی سنتز می‌شوند و صدها بار قابل استفاده هستند. عیب عمده آن‌ها گزینش‌گری محدودشان است.
کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبی در شرایطی تقریباً کاملاً متضاد با کروماتوگرافی تبادلی یونی انجام می‌شود. نمونه در بافری با غلظت بالای نمک، در ستون بارگذاری می‌شود؛ به همین دلیل، این روش را می‌توان پس از خالص‌سازی اولیه نمونه در یک ستون کروماتوگرافی تبادل یونی که پروتئین در غلظت بالای نمک از ستون خارج می‌شود به کار برد. گزینش‌گری، در کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبی کاملاً متفاوت با کروماتوگرافی تبادل یونی است زیرا در این روش از اصول کاملاً متفاوتی برای جداسازی استفاده می‌شود. در روش نخست، پروتئین‌ها براساس مناطق هیدروفوبی در ساختارشان جدا می‌شوند در حالی که تفاوت در بار، تأثیری بر انتخاب‌گری پروتئین‌ها ندارد. کروماتوگرافی برهم‌کنش هیدروفوبی به‌طور کلی، روشی ملایم است. آسیب به ساختار بیومولکول‌ها در حداقل میزان است که احتمالاً به دلیل اثر پایدار کننده نمک و برهم‌کنش ضعیف با ماتریس ستون است. بازیافت نمونه از ستون در حد بالایی انجام می‌شود.