دستگاه لومینسانس از بخش‌های متفاوتی تشکیل شده است. منبع، تک‌فام‌ساز، صافی، محفظه نمونه، آشکارساز و پردازنده این اجزا هستند که به تفصیل و با جزئیات تکنیکی توضیح داده شده‌اند. منبع نوری باید پایدار بوده و شدت بالایی از تابش را فراهم آورد. در مقابل آشکارساز نیز باید با قدرتمندی تمام، نشر کم توان از ماده را به سیگنال الکتریکی تبدیل کرده و به پردازشگر گسیل دارد. انواع منابع، صافیها و تکفامسازها آورده شده و معایب و مزایای هر یک بررسی شده است.
این مقاله شامل سرفصل‌های زیر است:
1- مقدمه
2- اجزای دستگاهی سامانه های لومینسانس
1-2- منبع برانگیختگی (Excitation Source)
2-2- طول موج گزینها (Wavelength Selection Devices)
3-2- محفظه‌های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
4-2- آشکارساز (Detector)
5-2- پردازش داده (Signal Processing)
3- نتیجه‌گیری
1- مقدمه
یک دستگاه لومینسانس از بخش‌های اصلی مختلفی تشکیل شده است. این دستگاه شامل منبع (Source)، تک‌فام‌ساز (Monochromator) یا صافی (Filter)، محفظه‌های نگهدارنده نمونه (Sample Holder)، آشکارسازهای بسیار حساس مثل لوله فوتوتکثیرکننده (Photomultiplier Tube) و سیستم‌های پردازش داده است. انواع طراحی دستگاه‌های لومینسانس در مقاله ” نکات عملی روش لومینسانس” آورده شده است. بر این اساس فلورومترها و اسپکتروفلورومترها دو طراحی دستگاهی برای روش فلوروسانس هستند که کارآیی مختلفی دارند. در این مقاله هریک از اجزای این دستگاه به تفصیل توضیح داده شده است.
2- اجزای دستگاهی سامانه های لومینسانس
1-2- منبع برانگیختگی (Excitation Source)
در اغلب شرایط، سیگنال فوتولومینسانس به طور مستقیم با شدت نور تابشی به نمونه متناسب است. بنابراین یک منبع برانگیختگی ایده‌آل باید شدت نور پایدار و زیادی در طول موج برانگیختگی مورد نظر ایجاد کند. استفاده از لنزها یا آینههای مناسب در منابع معمولی منجر می‌شود که بیشترین مقدار ممکن از نور منبع جمع‌آوری شده، تصویری از نور منبع به درون سل نمونه تابانده شود. انعکاسدهندههای بیضوی شکل (Elliptical Reflector) بیشترین کارایی را در جمع‌آوری نور منبع دارند. انعکاسدهندهها و منبع میتوانند به صورت واحدهای مستقل از یکدیگر عمل کنند یا در مجموع یک واحد جداییناپذیر را تشکیل دهند. در فلورومترهای ساده از یک لامپ قوس الکتریکی جیوهای با فشار پایین (Low Pressure Mercury Arc Lamp) استفاده می‌شود. این لامپ خطوط طیفی شدیدی در 254، 312 و 365 نانومتر ایجاد میکند که هر سه، طول موجهای مناسبی برای برانگیختگی اکثر مولکولها هستند. در صورتی که این لامپها با ترکیبات لومینسانسکننده (Phosphors) پوشانده شوند، طول موج نشری در آنها به مقادیر بالاتر جابه‌جا می‌شود (به عنوان مثال از 254 به 280 نانومتر) و همینطور کاهش شدیدی در درخشندگی لامپ را در پی دارد. در اسپکتروفلورومترهای تجاری، متداولترین منبع، لامپ قوس الکتریکی زنون (Xenon Arc Lamp) با فشار بالا (در محدوده 75 تا 450 وات) است. به علاوه از لامپهای جیوهای و زنون-جیوه با فشار بالا نیز استفاده می‌شود. میزان درخشندگی در طول موجهای نشری جیوه بسیار بیشتر از درخشندگی لامپ زنون در همین طول موج‌هاست. لامپهای قوس الکتریکی به منابع تغذیه (Power Supply) بزرگی نیاز دارند که قادر باشد ولتاژ 15 تا 30 ولت و جریانهای 5 تا 20 آمپر را ایجاد کند. معمولاً منبع تغذیه طوری طراحی می‌شود که ولتاژ در نزدیکی قوس الکتریکی ثابت بماند تا جریان و در نتیجه درخشندگی ثابتی ایجاد شود. در لامپهای قوس الکتریکی در حین گرم شدن، قوس الکتریکی بین الکترودها جابه‌جا می‌شود. به این پدیده سرگردانی قوس الکتریکی (Arc Wander) گفته می‌شود. سرگردانی قوس باعث تغییرات ناگهانی در سیگنال لومینسانس می‌شود؛ به خصوص زمانی که تصویر قوس الکتریکی بر یک روزنه (Slit Aperture) کوچک منعکس شود. در بعضی مواقع سرگردانی قوس را میتوان با قرار دادن لامپ در یک میدان مغناطیسی متناوب کاهش داد. برای جلوگیری از خطر ناشی از تولید اوزون در لامپهای با فشار بالا، محفظه نگهداری لامپ باید با دقت مهر و موم شود. لامپهای قوس الکتریکی از جنس زنون که به صورت پالسی عمل میکنند به عنوان منابع برانگیختگی در لومینسانس بسیار مورد توجه هستند. این لامپها نسبت به لامپهای قوس الکتریکی که با جریان مستقیم کار میکنند، درخشندگی نسبی بزرگتری در طول موجهای کمتر از 300 نانومتر دارند. این لامپها برای اندازهگیریهای فسفرسانس به شیوه Time Resolved مورد استفاده قرار میگیرند. لامپهای دوتریوم برای برانگیختگی در طول موجهای کمتر از 300 نانومتر مناسب هستند. در طول موجهای کمتر از 300 نانومتر درخشندگی لامپهای قوس الکتریکی جیوه و زنون که با جریان مستقیم کار میکنند به شدت کاهش مییابد. ممکن است تصور شود که نور لیزرها به دلیل درخشندگی بیشتر، گزینههای مناسبتری در مقایسه با منابع معمولی در اندازهگیریهای فلورسانس باشد. علاوه بر این که نیازی به استفاده از انتخابگر طول موج برانگیختگی نخواهد بود. در حال حاضر کاربرد لیزرها در سیستم‌های تجاری به جز در مواردی که هدف اندازهگیری طول عمر فلورسانس باشد، محدود است. حد تشخیص (یکی از خصوصیات تجزیهای روش که بیانگر توانایی دستگاه در آنالیز نمونه است) برانگیختگی با لیزر معمولاً در حد سیستمهایی است که در آنها از منابع معمولی با شدت بالا استفاده می‌شود. در مقایسه با منابع معمولی، لیزرها گرانتر و پیچیدهترند، نگهداری آنها سختتر بوده و پایداری کمتری دارند. به علاوه تجزیه شدن نمونه به دلیل شدتهای بالای نور لیزر یک مشکل اساسی تلقی می‌شود. لیزرها و لامپهای قوس الکتریکی که به صورت پالسی عمل میکنند، به پردازندههایی با قیمتهای بالاتر و پیچیدگی بیشتر نیاز دارند. با این وجود اسپکتروفلورومترهای مبتنی بر لیزر در برخی از آزمایشگاههای تحقیقاتی ساخته شده‌اند. معروفترین لیزرها عبارتند از: لیزر نیتروژن پالسی (337.1 نانومتر)، لیزر آرگون (488.8 و 514.6 نانومتر) و لیزرهای رنگی قابل تنظیم (Tunable Dye Lasers). طول موج حاصل از لیزر نیتروژن برای برانگیختگی بسیاری از گونهها مناسب است. لیزرهای آرگون کاربردهای محدودتری دارند زیرا درصد مولکولهایی که توسط طول موجهای نشر شده از این لیزرها برانگیخته میشوند، کم است. لیزرهای رنگی مناسبترین هستند زیرا در این نوع از لیزرها تنظیم طول موج برای هر مولکول خاصی امکانپذیر است. لیزرهای رنگی پالسی با پهنای پالس کمتر از 1 نانوثانیه برای اندازهگیری طول عمر لومینسانس بسیار مناسب هستند.
2-2- طول موج گزینها (Wavelength Selection Devices)
در اسپکتروفلورومترها از تک‌فام‌ساز (Monochromator) و در فلورومترها از صافی (Filter) به عنوان انتخابگر طول موج استفاده می‌شود. پیکربندی هر دو نوع دستگاه در شکل (1) نشان داده شده است.
طول موج مرکزی و پهنای باند (Band Pass) طول موج گزینهای جذبی و نشری به نحوی انتخاب میشوند که سیگنال فلورسانس را به حداکثر و سیگنال زمینه را به حداقل برسانند. افزایش پهنای باند برانگیختگی با منابع پیوسته موجب افزایش توان تابشی برخوردی به نمونه می‌شود. به طور معمول پهنای باند برانگیختگی از 0.1 پهنای باند جذبی در نصف ارتفاع بزرگتر است.
در ابتدای امر ممکن است به نظر برسد که این امر میتواند منجر به غیرخطی بودن ارتباط سیگنال با غلظت آنالیت (Nonlinearity) بشود، همچنان که در اسپکتروسکوپی جذبی به دلیل وجود نور چند رنگ (Polychromatic) با این پدیده مواجه میشویم. این مسئله در غلظتهای پایین آنالیت مشکلی ایجاد نمیکند. در واقع در غلظتهای پایین از آنالیت توان تابشی جذب شده متناسب با غلطت آنالیت است، حتی اگر ضرایب جذب مولی طول موجهای پهنای باند برانگیختگی متفاوت باشد. هر چه پهنای باند برانگیختگی کوچکتر باشد، گزینشپذیری بیشتر است. افزایش پهنای باند نشری با توجه به پهنتر بودن آن (100-20 نانومتر)، منجر به افزایش سیگنال فلورسانس می‌شود. هر چند تنظیم پهنای باند نشری باید به نحوی انجام شود که سیگنال آنالیت از سیگنال زمینه و پخش رامان (Raman Scattering) قابل تشخیص باشد؛ بنابراین دور از انتظار نخواهد بود اگر فیلترها را طول موج گزینهایی با توانایی بالا بدانیم. با توجه به بزرگتر بودن پهنای باند یک فیلتر در مقایسه با تک‌فام‌ساز، توانایی فیلتر 10 تا 100 برابر از تک‌فام‌ساز بیشتر است. علاوه بر آن سیستم‌های اپتیکی که برای فیلترها استفاده میشوند، عملکرد سریعتری دارند. فیلترهای تقاطعی (Cut off Filter) و جذبی (Absorption band Filters)، گستره پهن‌تری از طول موجها را عبور داده و برای جدا کردن یک یا دو خط طیفی از منابع جیوهای با فشار پایین کافی هستند. این فیلترها قادرند گستره طول موجی را که در آن فلورسانس آنالیت اتفاق میافتد، عبور دهند. پهنای باند باریکتر فیلترهای تداخلی (Interference Filter)، گزینشپذیری بیشتری نسبت به فیلترهای جذبی ایجاد میکند. در مقابل، توانایی فیلترهای تداخلی به دلیل عبور کمتر نور، کمتر است. نکتهای که در انتخاب فیلتر باید به آن توجه داشت این است که خود فیلترها خاصیت فلورسانی ضعیفی داشته باشند. در صورتی که به گزینشپذیری بالاتری نیاز باشد میتوان از دو یا چند فیلتر استفاده کرد.
به طور معمول در اسپکتروفلورومترها از تکفامسازهایی با تفکیکپذیری (Resolution) متوسط استفاده می‌شود. تفکیکپذیری معادل 1 نانومتر برای اکثر کاربردها مناسب است. برای آنالیز کمی، پهنای شکاف بزرگ (0.5 تا 2 میلی متر) و پهنای طیفی 4 تا 20 نانومتر نیاز است.
پایین بودن تابش هرز (Stray Radiation) یکی از الزامات اندازهگیریهای فلورسانس است. کسر کوچکی از نور منبع در طول موجهای بلندتر میتواند به عنوان تابش هرز از تک‌فام‌ساز برانگیختگی عبور کرده، توسط نمونه پراکنده شود و با عبور از تک‌فام‌ساز نشری آشکاسازی شود. اثرات ناشی از تابش هرز با استفاده از توریهای هولوگرافیک (Holographic Grating)، تکفامسازهای دوگانه (Double Monochromator) یا صافیهای تقاطعی به حداقل میرسد. در برخی مواقع یک فیلتر جذبی مادون قرمز بین منبع و تک‌فام‌ساز برانگیختگی گذاشته می‌شود تا نور شدید نشر شده در ناحیه مادون قرمز را که توسط لامپهای قوسی با فشار بالا نشر می‌شود، مسدود کند. این امر منجر به کاهش گرم شدن نمونه و در نتیجه کاهش تخریب گرمایی فیلترها و شکافها می‌شود.
3-2- محفظه‌های نگهداری نمونه (Sample Compartment or Sample Cells)
محفظه نگهداری نمونه شامل یک نگهدارنده سلول نمونه (Cell Holder) است که باعث می‌شود مکان سلول نمونه به شکل تکرارپذیری ثابت باشد. همانند دستگاه‌های جذب مولکولی، در فلورومترها و اسپکتروفلورومترها امکان قرارگیری چندین نگهدارنده و همچنین امکان کنترل دمای سلول و همینطور هم زدن محلول درون سلول فراهم شده است. انواع مختلفی از سلولهای نمونه در این دستگاهها استفاده میشوند. در مورد فلورومترهای ساده، سلولهایی به شکل لوله آزمایش مورد استفاده قرار میگیرند. در اغلب اوقات از سلولهای مربعی شکل با ابعاد 4.3×1×1 سانتیمتر استفاده می‌شود. بر خلاف سلولهای جذبی که از دو سمت مخالف صیقل داده میشوند، این سلولها از هر چهار طرف صیقلی هستنند. جنس سلولهای لومینسانس در برخی موارد از شیشه معمولی و در اغلب موارد از سیلیکای سنتزی جوش خورده (Fused Silica) با کیفیت بالا است. سلولهایی که از جنس سیلیکای جوش خورده ساخته میشوند، قادرند درصد زیادی از طول موجهای ناحیه UV را از خود عبور دهند. این سلولها کمترین میزان فلوسانس را از ساختار خود نشان میدهند. در مورد محلولهای با حجم کم، سلولهایی با ابعاد میکرو طراحی شده است. در مواردی مثل آشکارسازهای دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (به مقاله HPLC مراجعه شود)، که محلول حاوی آنالیت، یک جریان پیوسته دارد، از سلولهای جریان پیوسته (Flow Cell) با حجم کم استفاده می‌شود. تمامی انواع سلولهایی که برای فلورسانس ذکر شد، برای اندازهگیریهای فسفرسانس در دمای اتاق و شیمی لومینسانس مناسب هستند. در صورتی که اندازهگیری در دماهای پایین انجام شود، سلولهای با طراحی خاص نیاز است.
برانگیختگی و نشر در سلولهای لومینسانس با سه شکل هندسی متفاوت میتواند انجام شود که در شکل 3 به نمایش درآمده است. در شکل الف، نور نشر شده در زاویه 90 درجه نسبت به نور برانگیختگی اندازهگیری می‌شود. در این حالت سیگنال ناشی از پراکندگی کمترین شدت را داشته و به همین دلیل فرم الف بیشترین کاربرد را دارد. به علاوه، سهم فوتولومینسانس مربوط به دیواره سلول حداقل است زیرا دیوارههایی که از سلول به صورت مستقیم تحت تابش نور منبع قرار میگیرند، به طور مستقیم توسط آشکارساز دیده نمیشوند، بلکه تنها لومینسانس مربوط به حجم کوچکی از نمونه در مرکز سلول مشاهده می‌شود. این امر در محلولهایی که جذب زیادی دارند، مشکلساز است. چرا که قبل از رسیدن نور به مرکز سلول، مقدار زیادی از آن جذب می شود. به این اثر، پیش فیلتر ( Prefilter Effect) گفته می شود. در صورتی که مقدار زیادی از سیگنال نشر شده قبل از خروج از سلول، توسط مولکولهای آنالیت سر راه جذب شود، به این اثر، Post filter Effect گفته می‌شود. در شکل 3-ب برانگیختگی و نشر در یکی از چهار دیواره سلول نمونه انجام می‌شود (Frontal Geometry). بنابراین تضعیف سیگنال لومینسانس توسط جاذبها کاهش مییابد. این شکل فضایی برای محلولهای با جذب قوی و جامدات غیرشفاف مناسب است. شکل 3-ج، فرم همراستا (In line Geometry) را نشان میدهد که در آن نور نشر شده در زاویه 180 درجه نسبت به نور برانگیختگی اندازهگیری می‌شود. این حالت کمتر مورد استفاده قرار میگیرد چرا که طول موج گزین باید سیگنال برانگیختگی را از از سیگنال ضعیف نشری تشخیص دهد. در صورتی که طول موج برانگیختگی و نشر یکسان باشد، میتوان پروفایل طیف جذبی را به دست آورد.
4-2- آشکارساز (Detector)
حساسیت پایین بسیاری از آشکارسازهای تجاری مانع از کاربرد آنها به عنوان آشکاساز فلورومترها و اسپکتروفلورومترها است چرا که توان تابشی سیگنال نشر شده بسیار کم است. در اندازهگیریهای تک طول موجی به طور معمول از فوتولوله تکثیرکننده (Photo Multiplier Tube-PMT) به عنوان آشکارساز استفاده می‌شود. سطح جریان تاریکی (Dark Current) و نوفه جریان تاریکی در این آشکارسازها پایین است. برای روبش کامل طیف نشری، از آشکارسازهای چندکانالی (Multichannel Detector) همانند آرایههای دیودی (Diode Array) استفاده می‌شود. این امر به خصوص برای مطالعات سینتیک و شیمی لومینسانس که در آنها غلظت گونههای لومینسانسکننده (و در نتیجه سیگنال لومینسانس) با زمان تغییر میکند، مناسب است. استفاده از آرایههای دیودی در اسپکتروفوتومترها متداولتر از اسپکتروفلورومترها است.
5-2- پردازش داده (Signal Processing)
جریان فوتوآندی حاصل از فوتولوله تکثیرکننده ابتدا به ولتاژ تبدیل می‌شود. ولتاژ حاصل توسط تقویتکنندههای عملیاتی (Operational Amplifier) تقویت شده و سیگنال خروجی توسط یک ولت متر دیجیتالی به نمایش در میآید. به منظور کاهش سوق (Drift) و نوفه دستگاه، میبایست از قطعات الکترونیکی آنالوگ با کیفیت بالا استفاده کرد. برای افزایش نسبت سیگنال به نوفه، مدت زمان جمع‌آوری داده (Integration Time) در گستره 0.1 تا 10 ثانیه انتخاب می‌شود. سرد کردن فوتولوله تکثیرکننده منجر به کاهش جریان تاریکی و نوفه شده و در نتیجه نسبت سیگنال به نوفه افزایش مییابد. در برخی از اسپکتروفلورومترها، منبع برانگیختگی به وسیله برشگر مکانیکی (Mechanical Chopper) مدوله شده و سیگنال حاصل پردازش می‌شود. به این ترتیب میتوان بین سیگنال تاریکی، جریان تاریکی f-1 و نوفه تقویتکننده تمایز قایل شد. همانند اسپکتروفوتومترها، کابرد میکروکامپیوترها در دستگاه‌های لومینسانس توانایی این دستگاهها را به طرز چشمگیری بهبود میدهد. کنترل پارامترهایی مثل سرعت اسکن طول موج، گستره اسکن طول موج، پهنای شکاف و زمان جمع‌آوری داده توسط صفحه کلید فراهم شده است. دادههای حاصل از اندازهگیری بعد از ذخیره در کامپیوتر، توسط گزینههایی که در نرمافزار آنالیز دستگاه وجود دارد، مورد پردازش بیشتر قرار میگیرد. به عنوان مثال امکان انجام عملیاتی مثل کم کردن سیگنال شاهد، محاسبه یا نمایش طیف مشتق، فیت کردن دادههای کالیبراسیون و محاسبه غلظت آنالیت، محاسبه اطلاعات آماری و هموار کردن طیفها (Smoothing). همینطور نرمافزارهای خاصی در دسترس هستند که قابلیت کاربردهای خاصی را فراهم میکنند مثل مطالعات سینتیکی، آشکارسازی در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا و آنالیز مخلوطها.
3- نتیجه‌گیری
از جمله ویژگیهایی که در مورد دستگاه‌های کارآمد برای آنالیز ترکیبات فلورسانسکننده حائز اهمیت است، میتوان به چند مورد اشاره کرد:
1) حساسیت بالا به این مفهوم که دستگاه بتواند غلظتهای بسیار کم را نشان دهد.
2) سرعت اسکن بالا از این نقطه نظر که حجم زیادی از دادههای مورد نیاز را در مدت زمان بسیار کمی جمع‌آوری کند، این مسئله موجب آسیب کمتری به نمونه در اثر تابش نور می‌شود.
3) تطبیقپذیر باشد به این مفهوم که بسته به نوع استفادهای که از دستگاه می‌شود، برای نمونههایی با حالتهای فیزیکی متفاوت بتوان از آن استفاده کرد، علاوه بر اینکه دسترسی به گستره وسیعی از بازههای زمانی، طول موجی و دمایی را فراهم کند.
یکی از متداولترین منابع مورد استفاده در فلورومترها، لامپهای جیوه ای با فشار پایین هستند. این منابع بسیاری از طول موجهای مورد نیاز را برای برانگیختگی ترکیبات فلورسانسکننده به صورت گسسته فراهم میکنند. فیلترهای جذبی به طور معمول در فلورومترها مورد استفاده قرار میگیرند. از جمله منابع پیوسته متداول در اسپکتروفلورومترها لامپ ای قوس الکتریکی زنون با فشار بالا هستند. در اسپکتروفلورومترها از یک یا دو مونوکروماتور توری استفاده می‌شود.
منابـــع و مراجــــع
