فازهای ساکن کایرال در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

فازهای ساکن کایرال بسیاری وجود دارند، اما به‌طور متداول پنج نوع فاز ساکن کایرال در کروماتوگرافی مایع مورد استفاده قرار می‌گیرد. اولین نوع، فازهای ساکن پروتئینی هستند که از اتصال پروتئین‌های طبیعی به سیلیکا به وجود می‌آیند. از آنجایی که پروتئین‌ها دارای تعداد زیادی مراکز کایرال هستند، می‌توانند با مولکول‌های کوچکی که گزینش‌گری کایرالی بالایی دارند، برهم‌کنش ایجاد نمایند. دومین نوع فازهای ساکن کایرال که پیرکل پیشگام ساخت آن است، از ترکیبات کایرال با وزن مولکولی پایین که به سیلیکا اتصال یافته‌اند تشکیل شده‌است.

هر گروه اتصال یافته تعداد محدودی مرکز کایرال در دسترس دارند اما به علت اندازه کوچک این مولکول‌ها، تعداد زیادی از آن‌ها را می‌توان به سیلیکا متصل ساخت. به همین دلیل نمونه مورد آنالیز با احتمال بالاتری با مراکز کایرال برهم‌کنش انجام می‌دهند. سومین نوع فازهای ساکن پلیمری، فازهای ساکن پلیمری بر پایه سلولز و آمیلوز هستند که توسط اوکاماتو توسعه یافتند. در این نوع فاز ساکن، گروه‌های برهم‌کنش کننده موردنظر به سلولز اتصال یافته و سپس روی بستر سیلیکا پوشش داده می‌شوند. چهارمین نوع فازهای ساکن، گلیکوپپتیدهای ماکروسیکلیک هستند که به وسیله آرمسترانگ معرفی شدند. این نوع فازهای ساکن هم دارای تعداد زیادی مراکز کایرال به همراه حفره‌های مولکولی هستند که مولکول‌های حل شونده می‌توانند وارد آن‌ها شده و با گروه‌های همسایه برهم‌کنش داشته باشند. ویژگی‌های فضایی مولکول حل شونده، درجه ورود مولکول‌ها و متعاقب آن میزان برهم‌کنش را تعیین می‌کند که این عامل بر میزان انرژی برهم‌کنش و بزرگی درجه بازداری تأثیرگذار است. در نهایت، پنجمین گروه فازهای ساکن، فازهای سیکلودکسترینی هستند که چگونگی بازداری آن‌ها مشابه بازداری در کروماتوگرافی گازی است. در کروماتوگرافی مایع، فازهای ساکن سیکلودکسترینی به بسترهایی چون سیلیکا اتصال یافته و با روش مشابه ساخت فازهای معکوس ساخته می‌شوند.

این مقاله شامل سرفصل‌های زیر است:
1- مقدمه
2- فاز‌های ساکن کایرال
1-2- فازهای ساکن پروتئینی
2-2- فازهای ساکن نوع پیرکل
3-2- فازهای ساکن بر پایه مشتقات سلولز و آمیلوز
4-2- فازهای ساکن ماکروسیکلی گلیکو پپتیدی
5-2- فازهای ساکن سیکلودکسترینی
6- شبکه آزمایشگاهی فناوری راهبردی
7-نتیجه گیری

در سال 1966 يک گروه از موسسه علمي وایزمن برای نخستین بار، اولين جداسازي موفق انانتيومرها را با استفاده از کروماتوگرافي گازي گزارش دادند. پيشرفت‌هاي بعدي در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا باعث پيشرفت بيشتري در اين زمينه شد [1]. امروزه بيش از 60 نوع ستون وجود دارد که توانايي جداسازي انانتيومرها را دارا هستند. چالش بزرگ پیش رو، روش آزمون و خطا براي انتخاب يک ستون خاص براي جداسازي کايرال است.
تشکيل دياسترومرها براي اهداف کروماتوگرافي مي‌تواند به دو روش انجام شود: روش اول، تشکیل دياسترومرهاي ناپايدارکه مابين انانتيومرها و فاز ثابت کايرال (CSP) در طول فرآيند کروماتوگرافي اتفاق مي‌افتد که جداسازي مستقيم ناميده مي‌شود. روش دوم، توليد دياسترومرهاي پايدار است که از واکنش شيميايي بين انانتيومرهای مورد نظر و معرف مشتق‌ساز کايرال پیش از کروماتوگرافي به‌وجود مي‌آيد. چنين فرآيندي، جداسازي غيرمستقيم ناميده مي‌شود. جداسازي غيرمستقيم انانتيومرها تنها زماني که جداسازي مستقيم با شکست مواجه مي‌شود، روش مناسبی است.
مسير استرئوشيميايي واکنش دو ترکيب کايرال (راسميک A و راسميک B) براي ايجاد پيوند کووالانسي بدون تاثير روي مرکز نامتقارن به‌صورت زیر خواهد بود [2].

[(±)-A] + [(±)-B] → [+A+B] + [+A-B] + [-A+B] + [-A-B]

اولين و آخرين ترکیب، يک جفت انانتيومر و دومين و سومين ترکيب، جفت انانتيومر دوم را تشکيل مي‌دهند. در مقابل، اولين و سومين محصول و دومين و چهارمين محصول هم با یکدیگرجفت‌هاي دياسترومر هستند. در يک محيط کايرال هر چهار محصول باید قابل جداسازی باشند. هر چند، به دليل اينکه دياسترومرها ویژگی‌های فيزيکی وشيميايي متفاوتی دارند، کروماتوگرافي غيرکايرال اين مخلوط منجر به دو پیک می‌شود.
به‌منظور ایجاد یک محیط کایرال دو راه اصلی وجود دارد که یکی استفاده از فاز متحرک کایرال و دومی استفاده از فاز ساکن کایرال است. در ادامه به اجمال به مزایا و معایب راه نخست پرداخته و استفاده از فاز ساکن کایرال نیز که هدف اصلی این نوشتار است به تفصیل مورد بحث قرار خواهد گرفت.
فازهاي متحرک کايرال به‌صورت گسترده در کروماتوگرافي در سال‌هاي1980-1960استفاده شدند. ترکيب‌هاي فعال که قادر به تشکيل کمپلکس‌های جفت يون فلزی و قفسی بودند به‌منظور ايجاد گزینش‌گری کايرال در کروماتوگرافي فاز معکوس متداول و همچنین کروماتوگرافي فاز نرمال به فاز متحرک در حضور ستون‌های غيرکايرال اضافه شدند.
استفاده از فازهاي متحرک کايرال معايب و همچنین مزايایی دارد. براي مثال، تعادل‌های چند گانه‌ای که در فاز متحرک و فاز ثابت اتفاق مي‌افتد، توضيح سازوکار جداسازي را پيچيده‌تر مي‌کند. حضور ماده افزوده شده به فاز متحرک آشکارسازی را دشوار می‌سازد. براي مثال، زماني که از شناساگر UV استفاده مي‌شود، افزاينده‌هايي با جذب UV نسبتا بالا حد تشخيص انانتيومرهاي جدا شده را کاهش مي‌دهد. علاوه‌بر اين، انانتيومرهاي تبديل شده به فرم‌ کمپلکس با ليگاند کايرال وارد سل آشکارساز مي‌شود. اين کمپلکس‌ها دياسترومر هستند، بنابراين از نظر میزان جذب و همچنين ویژگی‌های ديگر نیز ممکن است تفاوت داشته باشند. در نتيجه لازم است که براي هر انانتيومر يک منحني کاليبراسيون جداگانه وجود داشته باشد. از طرف ديگر، استفاده از فاز متحرک کايرال مزایایی نیز دارد که آن را بسیار جذاب مي‌کند. بسیاری از افزاينده‌هاي کايرال به سادگي در دسترس هستند و يا به آساني سنتز مي‌شوند و همچنین می‌توان از فاز ثابت غيرکايرال که به‌صورت چشمگيري از فازهاي ثابت کايرال ارزانتر هستند، استفاده نمود. در اين روش، فاز متحرک کايرال مي‌تواند به آساني از دستگاه کروماتوگرافي شسته شود و همچنين با يک افزاينده ديگر براي جداسازي‌هاي بعدي جايگزين شود. فاز متحرک کایرال انعطاف‌پذيري بيشتري نسبت به جداسازي مستقيم در مقایسه با فازهاي ثابت کايرال ارائه مي‌کند.

تعدادی فاز ساکن پروتئینی تجاری وجود دارند که برای جداسازی دسته وسیعی از ترکیبات مورد استفاده قرار می‌گیرند. 1α-اسید گلیکوپروتئین که با نام Chiral-AGP فروخته می‌شود، پروتئین بسیار پایداری است که به ذرات سیلیکای دارای قطر mµ5 اتصال یافته است. این فاز ساکن معمولاً با مخلوط دوگانه حلال‌ها که حاوی مقادیر کمی (10 – 1 درصد) از 2- پروپانول، اتانول یا استونیتریل هستند، به کار برده می‌شوند. میزان حلال می‌تواند بازداری مطلق انانیتومرها و همچنین گزینش‌گری کایرال را کنترل نماید.
در شکل (1) مثالی از اثر میزان حلال آلی بر بازداری و گزینش‌پذیری در کروماتوگرافی که جداسازی انانتیومرهای مترو پرولول را نشان می‌دهد، آورده شده‌است. هر قدر که میزان آب بیشتر و میزان حلال آلی کم‌تر باشد، بیشتر برهم‌کنش‌ها قطبی نبوده بلکه هیدروفوبی خواهند بود. همچنین دیده می‌شود که گزینش‌پذیری بیشتر فاز ثابت کایرال ناشی از کاهش مقدار 2-پروپانول بوده که با افزایش زمان بازداری نیز همراه است و این پدیده به آن معناست که هر قدر انانیتومری بیشتری با فاز ساکن برهم‌کنش داشته باشد به‌صورت خاصی با فاز ساکن، نسبت به ایزومر دیگر خود پیوند برقرار می‌کند.

فاز ساکن مذکور همچنین دارای گروه‌های یونی است که با روش یونی با حل شونده برهم‌کنش می‌کند، مشروط بر آن که pH فاز متحرک معادل pK_a گروه‌های یونی تنظیم شود تا گروه‌ها، قابل یونیزه شدن بوده و زوج یون تشکیل ندهند. نقطه ایزوالکتریک AGP معادل 2.5 است و نشان‌دهنده آن است که تا pH 7، بار منفی خواهد داشت. مثالی از تأثیر pH در جداسازی انانیتومرهای 2-فنوکسی پروپیونیک اسید را در کروماتوگرام شکل (2) می‌توان مشاهده نمود. همان‌گونه که در شکل مشاهده می‌شود، بازداری مطلق و گزینش‌گری کایرال هر قدر که pH کاسته می‌شود افزایش می‌یابد و تنها 2 واحد تغییر در pH از شستشوی هم‌زمان دو نمونه به جداسازی با فاکتور جداسازی بسیار بالا منجر می‌شود.
به‌طور کلی ستون‌های Chiral-AGP معمولاً برای جداسازی انانیتومرهای دارای گروه‌های آمین نوع دوم و سوم و ترکیبات دارای اتم نیتروژن در حلقه به کار می‌روند.

پروتئین دیگر با عملکرد مشابه، اوالبومین است که از سفیده تخم‌مرغ به‌دست می‌آید. به‌طور کلی شرایط کار با این نوع ستون‌ها مشابه AGP است، گرچه در برخی موارد تعویض ترتیب شستشوی انانیتومرها گزارش شده‌است. سلوبیوهیدرولاز روی سیلیکاژل تثبیت شده و به‌عنوان فاز ساکن بسیار موثری از آن استفاده می‌شود. این ستون به‌صورت تجاری با نام Chiral-CBH وجود دارد. این نوع ستون‌ها به ویژه برای جداسازی داروهای بازی، جداسازی انانیتومرهای حاوی گروه‌های آمین نوع اول و داروهایی چون نور متانفرین و اکتوپامین مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ستون‌ها با مخلوطی از 2-پروپانول یا استونیتریل به همراه بافر فسفات به‌عنوان فاز متحرک استفاده می‌شوند. از آنجایی که این ستون‌ها آنزیمی هستند و با فلزات به راحتی تخریب می‌شوند از یک عامل کیلیت کننده مانند اتیلن دی آمین تترا استات برای حذف هرگونه آلودگی فلزی در سیستم باید استفاده نمود. به شیوه مشابه Chiral-AGP بازداری و گزینش‌گری کایرال را می‌توان با pH فاز متحرک و میزان حلال آلی کنترل نمود.
دیگر فاز پروتئینی ساکن، از اتصال آلبومین سرم انسانی به بستر سیلیکا ایجاد می‌‌شود که این نوع ستون‌ها با نام تجاری Chiral-HSA وجود دارند.

هر سه فاز پروتئینی مذکور به شیوه مشابهی عمل می‌کنند و به‌طور کلی می‌توان گفت گزینش‌گری کایرال و بازداری با استفاده از pH و میزان حلال آلی فاز متحرک کنترل می‌شود. با این وجود گزینش‌گری برای هر زوج انانتیومر، از فاز ساکنی به فاز ساکن دیگر با آن که همه پروتئینی هستند، متفاوت است. این پدیده در شکل (3) نشان داده شده‌است که بازداری انانیتومرهای تالینولول و آتنولول با افزایش میزان 2-پروپانول در فاز متحرک کاهش می‌یابد که با در نظر داشتن آن که نیروهای پراکندگی مسئول بازداری هستند، قابل انتظار است. از سوی دیگر، گزینش‌گری کایرال فاز ساکن نسبت به دو انانیتومر با افزایش میزان 2-پروپانول افزایش می‌یابد. در این مورد واضح است که گزینش‌گری کایرال به علت افزایش نیروهای پراکندگی در برابر ایزومر بیشتر بازداری شده‌است و این پدیده مجدداً نشان می‌دهد که پیش‌بینی درجه گزینش‌گری کایرال در یک ستون کایرال خالص با نمونه‌های ناشناخته مشکل است. مجدداً باید تأکید شود که توجیه علت رفتار جداسازی ویژه، نسبتاً آسان است اما پیش‌بینی آن قبل از جداسازی مشکل است.

فازهای ساکن پیرکل فازهایی هستند که در آنها ترکیبات کایرال با وزن مولکولی پایین به سیلیکا متصل شده‌اند، این فازها تعداد محدودی مراکز کایرال دارند اما به علت اندازه کوچک این مولکول‌ها، تعداد زیادی از آن‌ها را می‌توان به سیلیکا متصل ساخت [3]. تعداد بسیاری از این فازها مورد مطالعه قرار گرفته و در جداسازی انواع مختلف ترکیبات کایرال استفاده شده‌اند. البته این نوع فازهای ساکن مشکلات دیگری نیز دارندکه ناشی از آرایش فضایی خاص مراکز کایرال و دیگر گروه‌های اطراف آن است. فاصله پیوند نسبتاً کوتاه عامل کایرال با سیلیکا، نزدیک شدن برخی از مولکول‌ها را محدود می‌کند؛ بنابراین، مراکز کایرال مولکول‌های موردنظر نمی‌توانند با مراکز کایرال فاز ساکن برهم‌کنش داشته باشند. با این وجود برای برخی مولکول‌های خاص، این آرایش فضایی مساعد است. به‌عنوان مثال، –LC-I و –LC-(S) دی نیترو بنزوییل فنیل گلایسین برای جداسازی انانیتومرهای 1-نفتیل متیل آمید ایبوپروفن به شیوه‌ای که در زیر نمایش داده شده‌است، مناسب هستند. آرایش فضایی اطراف مرکز کایرال نشان‌دهنده آن است که یکی از کنفیگوراسیون‌ها مناسب‌تر از دیگری است.

به‌منظور گسترده نمودن توانایی‌های فلزهای پیرکل، گروه‌های قطبی و گروه‌هایی که قابل قطبی شدن هستند به مولکول‌ها اضافه شدند. متداول‌ترین این نوع فازهای ساکن کایرال، فازهای (R,R) Whelk-01 و (S,S) Whelk-01 هستند. ساختار این فازها در شکل زیر نشان داده شده‌است.

این نوع فازها انعطاف‌پذیرتر بوده و کاربرد وسیع‌تری نسبت به فاز ساکن قبلی دارند. این مولکول‌ها به‌صورت کووالانسی به سیلیکا متصل شده‌اند و تقریباً با همه حلال‌ها قابل استفاده هستند. اما دیده شده‌است، زمانی که در روش فاز نرمال از آن‌ها استفاده می‌شود، عملکرد بهتری دارند. باید در اینجا خاطر نشان نمود که خصلت قطبش‌پذیری حلقه آروماتیک در عملکرد این فاز ساکن تأثیر به‌سزایی دارد.

از آنجا که فازهای ساکن پیرکل در هر دو فرم (R) و (S) وجود دارند، معکوس کردن ترتیب شویش یک جفت انانیتومر امکان‌پذیر است. این فاز ساکن در اصل برای جداسازی انانیتومرهای ناپروکسن طراحی شده اما به تدریج استفاده زیادی در جداسازی اپوکسیدها، الکل‌ها، دیول‌ها، آمیدها، ایمیدها و کاربامات‌ها پیدا کرده است.
دیگر فاز ساکن پیرکل که قطبیت بسیار بالایی دارد، با روش مشابهی سنتز شده و ساختار آن در زیر نشان داده شده‌است. این فاز ساکن هم بسیار متنوع و هم دارای گروه‌های برهم‌کنش کننده متعددی است که با گروه‌های مجاور مراکز کایرال نمونه مورد آنالیز برهم‌کنش می‌کنند. این فاز ساکن برهم‌کنش قطبی بسیار قوی از طریق گروه کربونیل، گروه آمید و حلقه آروماتیک نیترو دار خود ایجاد می‌کند. این نوع ستون‌ها را هم می‌توان در شرایط فاز نرمال و یا فاز معکوس به کار برد. در شکل (4) فاز متحرک می‌تواند شامل مخلوط (هگزان / اتانول) برای فاز نرمال و یا (آب / متانول) برای فاز معکوس باشد.

فازهای ساکن سلولزی امروزه در دسترس هستند که روی بسترهای سیلیکایی تثبیت شده و عمدتاً به دو دسته کلی تقسیم‌بندی می‌شوند؛ دسته‌ای که از پلیمرهای سلولزی و دسته‌ای که از پلیمرهای آمیلوزی مشتق شده‌اند. وزن مولکولی آن‌ها تا 000/40 دالتون گزارش شده‌است. تفاوت اساسی میان این دو دسته آن است که نوع سلولزی، ساختار خطی دارند در حالی که نوع آمیلوزی ساختار مارپیچی دارند. هر دو نوع سلولزی و آمیلوزی حاوی پنج مرکز کایرال است؛ به همین دلیل این پلیمرها دارای تعداد زیادی از مراکز فعال کایرال هستند و احتمال برهم‌کنش نمونه موردنظر با مراکز کایرال بسیار بالا است. ساختار نوع سلولزی به فرم زیر است:

این نوع فازهای ساکن به‌وسیله اوکاماتو توسعه یافته و امروزه دو مشتق اصلی آن (که در زیر ساختار آن‌ها نشان داده شده‌است) استفاده می‌شوند [4].

 

هر دو ساختار قادر به برهم‌کنش قطبی هستند؛ به علاوه هسته آروماتیک آنها می‌تواند خصلت قطبش پذیری را فراهم آورد و با هر گروه قطبی موجود در نمونه مورد آنالیز، برهم‌کنش‌های قوی ایجاد نماید. ساختار آمیلوزی تا حدی متفاوت است که در شکل زیر نشان داده شده‌است.

آمیلوز نیز با تریس (3، 5-دی متیل فنیل کاربامات) و تریس [(S)α—متیل بنزیل کاربامات] مشتق‌سازی می‌شود.

 

به دلیل آن که این نوع فازها روی سیلیکا پوشش‌دهی شده و به روش شیمیایی به آن متصل نمی‌شوند محدودیت‌هایی از نظر نوع، سرعت فاز متحرک و دمای اعمال شده وجود دارد. مخلوط هپتان / الکل حلالی است که به‌عنوان فاز متحرک توصیه می‌شود و نشان‌دهنده آن است که عمده نیروهای برهم‌کنش موثر بر بازداری و انتخاب‌گری، قطبی هستند. برای جلوگیری از دنباله‌دار شدن پیک‌ها که از حضور سایت‌هایی با فعالیت بسیار بالا ناشی می‌شود، مقادیر اندک از اسید آلی (تری فلورو استیک اسید) و یا باز آلی (تری اتیل آمین) معمولاً 0.16 درصد به فاز متحرک افزوده می‌شود و به بلوکه کردن سایت‌های فعال و بهبود تقارن پیک کمک می‌کند. در عمل دیده شده‌است که مشتقات خاص (به‌عنوان مثال، تریس (3، 5 – دی متیل فنیل کربامات)، مقاومت بیشتری نسبت به انحلال دارند. در نتیجه این فازهای ساکن را می‌توان با مخلوط متانول / آب یا استونیتریل / آب با احتیاط به کار برد. یک نمونه از جداسازی کایرال با شیوه‌های مختلف کروماتوگرافی در شکل (5) نشان داده شده‌است.

حلال استفاده شده در روش فاز معکوس، بافر آبی / متانول v/v 65.35 و در روش فاز نرمال، اتانول / هگزان v/v 95.5 بود. همان‌طور که قابل پیش‌بینی است، فاکتور جداسازی (α) در روش فاز معکوس 1.20 به‌طور قابل ملاحظه‌ای بزرگ‌تر از میزان آن در روش فاز نرمال 1.13=α است. این پدیده منعکس کننده برهم‌کنش‌های غیرقطبی بیشتر این مشتق نسبت به برهم‌کنش‌های قطبی آن است.
البته این نکته را هم باید مدنظر داشت که تغییر در روش کروماتوگرافی امری برگشت‌پذیر نیست. برای مثال، اغلب امکان‌پذیر است که روش قطبی را به روش کروماتوگرافی معکوس تغییر داد اما معمولاً تبدیل روش مجدد به روش قطبی امکان‌پذیر نیست. دلیل آن نیز برخی تغییرات مورفولوژیکی در فاز ساکن است که گزینش‌گری کایرال را از بین می‌برد.

فازهای ساکن کایرال ماکروسیکلی در ابتدا به وسیله آرمسترانگ معرفی شدند [5]. یکی از روش‌های ساخت این فازها اتصال کووالانسی وانکومایسین به سطح ذرات سیلیکاژل است. وانکومایسین دارای 18 مرکز کایرال است که سه حفره تشکیل داده‌اند و از طریق پنج حلقه آروماتیک به هم متصل هستند. گروه‌های قویاً قطبی مجاور ساختارهای حلقوی برهم‌کنش‌های قطبی قوی با ماده مورد آنالیز برقرار می‌کنند. این نوع فاز ساکن با فاز متحرک حاوی 100-0 درصد از حلال آلی پایدار است. ساختار وانکومایسین در شکل زیر نشان داده شده‌است. A، B و C حفره‌های نگهداری ماده مورد آنالیز هستند، pK‌های وانکو مایسین 2.9، 7.2، 8.6, 9.6، 10.4 و 11.7 و نقطه ایزو الکتریک آن 7.2 است.

وانکومایسین یک فاز ساکن کایرال بسیار پایدار است که ظرفیت نمونه نسبتاً بالایی دارد؛ زمانی که به سطح سیلیکاژل متصل می‌شود با فازهای متحرک که حاوی درصد آب بالایی هستند و همچنین با فاز معکوس و یا با حلال‌های آلی که درصد بالایی دارند، به‌عنوان یک فاز ساکن قطبی قابل استفاده است. به‌عنوان مثال، زمانی که به‌صورت فاز معکوس استفاده می‌شود، مخلوط قطبی آب / THF فاز متحرک بسیار موثری است. برعکس زمانی که از فاز ساکن قطبی استفاده می‌شود، مخلوط n-هگزان / اتانول مناسب است. وانکومایسین دارای تعدادی گروه قابل یونیزه شدن است که باعث می‌شود در محدوده pH‌های مختلفی (4pH تا 7pH) گزینش‌گری کایرال داشته باشد. بافرهای آمونیوم نیترات، تری اتیل آمونیوم استات و سدیم سیترات همگی با این فاز عملکرد رضایت‌بخشی داشته‌‌اند. به غیر از کنترل pH، اثر نوع بافر تأثیر کم یا بسیار ناچیزی بر گزینش‌گری کایرال دارد. این مسئله را می‌توان در کروماتوگرام نشان داده شده درشکل (6) مشاهده نمود که برای همه بافرها صرف‌نظر از ماهیت شیمیایی بافر، گزینش‌گری کایرال یکسانی به‌دست می‌آید.

در این نوع فازهای ساکن، حفره‌ها، کم عمق‌تر از حفرهای موجود در سیکلو دکسترین‌ها بوده بنابراین، برهم‌کنش‌ها ضعیف‌تر هستند. البته این امر باعث تبادل سریع‌تر نمونه میان فازها و کارایی بهتر ستون می‌شود.
از دیگر گلیکوپپتید ماکرولیتیک که در کروماتوگرافی کایرال استفاده می‌شود گلیکوپپتید آمفوتری تئی‌کوپلانین است که به‌صورت تجاری با نام CHIROBIOTIC T موجود است. این ترکیب نیز به ذرات سیلیکاژل با قطر mµ5 با پیوند کووالانسی متصل می‌شود. تئی کوپلانین 20 مرکز کایرال و چهار حفره دارد. گروه‌های همسایه به شدت قطبی هستند و حلقه آروماتیک، قطبش پذیری را فراهم می‌آورد. ساختار تئی‌کوپلانین در شکل زیر نشان داده شده‌است.

 

این فاز ساکن، مکمل فاز وانکومایسین است و با همان فازهای متحرکی که قبلاً ذکر شد، قابل استفاده است. این احتمال هم وجود دارد که در مورد یک ترکیب خاص یک فاز گزینش‌گری کایرال فراهم آورد در حالی که دیگری غیرگزینشگر باشد.

سه نوع سیکلودکسترین α، β و γ و یا مشتقات اتصال یافته آن‌ها به سیلیکا در کروماتوگرافی مایع مورد استفاده قرار می‌گیرند. ساختار سیکلودکسترین در شکل زیر نمایش داده شده‌است.

یک یا هر دو گروه‌های کربوکسیل نوع اول (موقعیت 6) را می‌توان برای اتصال سیکلودکسترین به سیلیکا مورد استفاده قرار داد. گروه‌های هیدروکسیل نوع دوم (موقعیت‌های 2 و 3) را می‌توان به‌طور گزینشی مشتق‌سازی نمود، به‌طور معمول ابتدا موقعیت (2) و سپس موقعیت (3) مشتق‌سازی می‌شود.
تعداد متنوعی از مشتقات سیکلودکسترین برای ایجاد انواع خاص و افزایش گزینش‌گری کایرال سنتز گردیده‌اند. داده‌های X-ray نشان‌دهنده آن است که ساختارهای β و γ صلب هستند در حالی که ساختار α مقداری انعطاف‌پذیرتر است. بنابراین، مولکول‌های حل‌شونده اگر از لحاظ فضایی ساختار مناسبی داشته باشند می‌توانند از طریق نیروهای پراکندگی یا یونی با گروه‌های همسایه نزدیک خود برهم‌کنش داشته باشند. وارد شدن یک حل شونده درون ساختار سیکلودکسترین در شکل شماره (7) نشان داده شده‌است. تفاوت ساختار فضایی دو ایزومر منجر به گزینش‌گری متفاوت می‌شود.

سیکلودکسترین‌ها می‌توانند غلظت بالای بافر را تحمل نموده و در ناحیه pH 3 تا 14 پایدار باشند. اما از آنجایی که سیلیکا در pH‌‌های بالاتر از 8، محلول است پایداری ماتریکس سیلیکا، پایداری فازهای سیکلودکسترینی را به محدوده 3 تا 7 محدود می‌سازد. فازهای ساکن سیکلودکسترینی در هر دو روش کروماتوگرافی فاز نرمال و یا معکوس مورد استفاده قرار می‌گیرند. همانند فازهای ساکن کایرال دیگر، برهم‌کنش‌های غیرقطبی با ساختارهای سیکلودکسترینی را می‌توان با استفاده از حلال‌های قطبی و برهم‌کنش‌های قطبی را با حلال‌های غیرقطبی کنترل نمود. درصورت حضور برهم‌کنش‌های یونی نیز می‌توان مقدار آن‌ها را با pH و نوع بافر کنترل نمود. تغییرات اندک در pH و تغییر نوع بافر می‌تواند بسیار تعیین کننده باشد. مثالی از اثر تغییرات pH و نوع بافر بر جداسازی انانتیومرهای یکی از مشتقات D، L-فنیل آلانین در شکل (8) آورده شده‌ است.

همان‌گونه که مشاهده می‌شود تغییر pH از 5 به 4 باعث افزایش قابل ملاحظه گزینش‌گری کایرال شده‌است. با تغییر نوع بافر از اسید استیک که pH آن با سود تنظیم شده به بافر تری اتیل آمینی که با استیک اسید تنظیم شده است، تغییر قابل ملاحظه ای در تفکیک دو انانتیومر رخ می دهد و این تغییر منجر به تفکیک کامل دوانانتیومر می شود. البته باید این مسئله را هم در نظر داشت که زمان بازداری از 18 دقیقه به 32 دقیقه افزایش یافته است که نشان‌دهنده آن است که برهم‌کنش میان حل‌شونده و فاز ساکن قوی‌تر و برهم‌کنش میان حل شونده و فاز متحرک ضعیف‌تر شده‌است.

یکی از تخصصی‌­ترین زمینه­‌های کروماتوگرافی، جداسازی انانتیومرهاست. امروزه فازهای ساکن کایرال متنوعی در اختیار پژوهشگران است که بنا به نوع ترکیب مورد آنالیز و برهمکنش‌­هایی که با فاز ساکن خواهد داشت انتخاب می­گردند. پنج نوع فاز ساکن کایرال به صورت متداول در کروماتوگرافی مورد استفاده قرار می‌گیرند که عبارتند از فازهای پروتئینی، پیرکل، پلی ساکاریدی، گلیکوپپتیدی و سیکلودکسترینی.
فازهای ساکن پروتئینی گزینش‌­گری بالایی داشته و دسته وسیعی از مواد را جداسازی می­کنند و از آنجا که با فازهای متحرک آبی قابل استفاده هستند برای نمونه‌­های بیولوژیکی استفاده می‌­شوند اما بسیار حساس بوده، ظرفیت نمونه کمی داشته و باید با دقت بالایی مورد استفاده قرار گیرند تا طول عمر مناسبی داشته باشند. جداسازی در ستون‌­های نوع پیرکل اغلب با فازهای متحرک غیرقطبی و یک حلال قطبی برای اصلاح قطبیت انجام می­شود. ساختار، نوع و غلظت حلال اصلاح کننده قطبیت اثر بسیار زیادی بر جداسازی دارد. اساس جداسازی در این فازها برهمکنش­‌های π-π ، پیوندهای هیدروژنی و برهمکنش های دو قطبی-دو قطبی است. ستون­‌های پلی ساکاریدی کاربرد وسیع، کارآیی بسیار خوب و ظرفیت نمونه بالایی دارند و در جداسازی­‌های تهیه‌­ای نیز می­توان از آن­ها استفاده نمود. ستون­های گلیکوپپتیدی از اتصال یک گلیکوپپتید به ذرات سیلیکاژل ساخته شده و ظرفیت نمونه نسبتاً بالایی نیز دارند. ستون‌­های سیکلودکسترینی را می­‌توان با همه انواع حلال‌­ها مورد استفاده قرار داد و همچنین در کاربردهای تهیه­‌ای نیز قابل کاربرد هستند. از آنجا که با حلال­‌های آبی نیز سازگار هستند برای آنالیز نمونه­‌های بیولوژیکی مناسب هستند.